王 尉 胡衛(wèi)列 呂 軍 聶海波 邱曉拂 趙永斌 肖遠(yuǎn)松 劉 俊

最近研究表明，Mel-18 可能是1種新的抑癌基因。有報道發(fā)現(xiàn)Mel-18 表達于正常乳腺組織，而在乳腺癌原代標(biāo)本中低表達或不表達，Guo 等[1～5]認(rèn)為增強乳腺癌細(xì)胞Mel -18 的表達，可降低乳腺癌細(xì)胞Akt/ PKB 的活性。盡管在人類許多腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了Mel-18基因的異常，但目前國內(nèi)、外尚鮮見Mel-18 與前列腺癌關(guān)系的報道。它與前列腺癌分期、轉(zhuǎn)移及預(yù)后之間是否存在相關(guān)關(guān)系；能否成為前列腺癌診斷及預(yù)后判斷的標(biāo)志物應(yīng)用于臨床，仍不十分明確。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

前列腺癌標(biāo)本取自廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院泌尿外科收治的前列腺癌患者，免疫組織化學(xué)采用辣根過氧化物酶法染色。

對廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院泌尿外科收治的202例前列腺癌患者病理組織標(biāo)本進行Mel-18免疫組織化學(xué)染色?；颊叩呐R床病理參數(shù)見表1。這些患者在前列腺癌確診前未接受過內(nèi)分泌等前列腺癌相關(guān)性治療，通過TNM 分期系統(tǒng)進行臨床及病理分期。自1997年至2003年期間，對76例接受根治性前列腺切除的局限性前列腺癌患者，進行生存分析，生存參數(shù)包括Gleason評分，包膜外浸潤、精囊受累、外科切緣、Mel-18染色強度等。對126例未接受根治性前列腺切除術(shù)的前列腺癌患者，包括61例伴骨轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者進行生存分析，病理組織取自前列腺穿刺活檢樣品，通過X線、CT、MRI 及骨掃描明確轉(zhuǎn)移情況。

76例接受根治性前列腺切除的局限性前列腺癌患者，平均年齡為(70.2±5.1)歲，平均隨訪時間為(36.3±22.8)月，術(shù)前平均血TPSA為(17.0±14.9)ng/ ml。病理分期T2、T3及T4分別為58.8％，34.7％ 及 6.5％。陽性切緣率為43.9％。Gleason評分<7、 7 及 >7 分別為20.7％、 43.0％ 及 36.3％。3年及 5年 PSA 無復(fù)發(fā)生存率分別為66.8％ 及 61.6％,中位隨訪時間為58.1個月。

1.2 方法

免疫組織化學(xué)采用辣根過氧化物酶法染色[6]。Mel-18 單抗購自Santa Cruz Biotechnology公司(C20， USA)。

①主要步驟：切片用二甲苯脫蠟，梯度酒精和蒸餾水水化。3％H2O2封閉內(nèi)源性過氧化酶20 min，自來水沖洗， 0.01 mol/L(pH7.4)洗。滴加一抗37℃孵育40 min， 4℃冰箱過夜PBS洗3次×5 min。滴加二抗37℃孵育40 min， PBS洗3次×5 min。滴加ABC試劑孵育60 min。PBS洗3次×5min。置0.03％ H2O2-DAB 溶液顯色20 min，自來水洗，蒸餾水洗。蘇木精復(fù)染2 min或不復(fù)染，自來水洗。脫水，透明，封片。陰性對照以TBS 取代一抗。一抗Mel -18使用濃度為1∶400。②結(jié)果判定：Mel-18陽性表達集中在細(xì)胞核， 表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色或者棕褐色顆粒。③按半定量積分判斷Mel-18蛋白表達結(jié)果， Mel-18陽性染色細(xì)胞呈黃色至棕黃色、棕褐色顆粒。陽性染色強度分為1～4級，1級:陰性，細(xì)胞核不著色或無顆粒；2級:輕度陽性，細(xì)胞核呈均勻淺黃色或有極少量顆粒;3級:中度陽性，細(xì)胞核呈棕黃色，顆粒占整個細(xì)胞核的1 /2;4級:重度陽性，細(xì)胞核中充滿棕褐色顆粒。Mel-18陽性染色密度(即陽性染色細(xì)胞百分率)亦分為1～4級， 1級:陽性細(xì)胞數(shù)0～5％， 2級:陽性細(xì)胞數(shù)6％～35％， 3級:陽性細(xì)胞數(shù)36％～70％， 4級:陽性細(xì)胞數(shù)71％～100％。為了比較組織間Mel-18表達水平的差異，每一組織切片的表達水平均以陽性染色總積分表示，總積分=該組織切片的陽性染色強度(1～4)×陽性染色密度(1～4)。依據(jù)總積分值，將Mel-18蛋白在組織中的表達水平分為陽性或陰性，≥4分為陽性表達，<4分為陰性表達[7]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

運用Logistic回歸分析法調(diào)整年齡，評價Mel-18蛋白與前列腺癌發(fā)病風(fēng)險、轉(zhuǎn)移性前列腺癌、病理高分級的相關(guān)性。PSA復(fù)發(fā)定義為根治性手術(shù)后大于0.2 ng/ml。使用Kaplan-Meier生存分析和單變量Cox成比例危險因子模型(univariate cox proportional harzards model)，評價影響患者無PSA復(fù)發(fā)生存率、癌特異性生存率及總生存率的的個體變量。除Mel-18蛋白表達量外，其他變量包括Gleason評分，術(shù)前PSA、Hb、LDH、AKP，腫瘤分期、病理分級和手術(shù)切緣情況。為同時評價包括Mel-18蛋白表達量對幾個變量的影響，使用多變量Cox比例危險模型(multivariate Cox proportional harzards model)，用Wald’s檢驗決定單變量和多變量Cox模型的統(tǒng)計學(xué)意義。顯著性水準(zhǔn)為0.05。數(shù)據(jù)在SPSS 10.0統(tǒng)計軟件包上完成。

2 結(jié)果

2.1 Mel-18表達與前列腺癌臨床病理特征的關(guān)系

前列腺癌組織中Mel-18 免疫組織化學(xué)染色分析表明，高Gleason 評分的癌組織較低Gleason 評分的癌組織染色強度降低。各組間染色分析結(jié)果表明：PSA≥100.1組較其它PSA組別染色陽性率減少(P=0.010)；T2N0M0組較其它分期組別染色陽性率增多(P=0.021)；Gleason評分8～10組較Gleason評分5～6組染色陽性率降低(P=0.031)；Gleason評分9,10組較Gleason評分5～8染色陽性率降低(P=0.026)(表1)。運用多變量Cox成比例危險因子模型(multivariate cox proportional hazards model)分析表明：陰性Mel-18的染色結(jié)果是伴生化復(fù)發(fā)或前列腺癌特異性生存的獨立預(yù)測因素(OR:2.143,95％CI:1.035～4.132；OR:2.365,95％CI:1.194～5.485)(表2，表3)。

2.2 Mel-18表達與生存情況的關(guān)系

按Mel-18染色結(jié)果分組進行生存分析，生存曲線分析表明：Mel-18陰性染色組較Mel-18陽性染色組，在PSA復(fù)發(fā)時間顯著縮短(P=0.029)(圖1A)，初診為D期的患者的癌特異性生存時間顯著縮短(P=0.025)(圖1B)。

表1 Mel-18表達與前列腺癌臨床病理特征的關(guān)系

表2 多變量Cox成比例危險因子模型分析伴前列腺癌生化復(fù)發(fā)生存的預(yù)測因素

表3 多變量Cox成比例危險因子模型分析前列腺癌特異性生存的預(yù)測因素

注：1 HR:hazard ratio,2 CI:confidence interval

圖1 Mel-18染色情況分層的Kaplan-Meier 生存曲線分析

3 討論

前列腺癌是西方國家男性最常見的惡性腫瘤之一，居男性癌癥死因的第二位。過去，我國前列腺癌發(fā)病率較低，但隨著人均壽命的延長、膳食結(jié)構(gòu)的改變及診斷技術(shù)的進步，其發(fā)病率在逐年提高，已躍居為男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第3位[8]。然而到目前為止，導(dǎo)致前列腺癌發(fā)生與進展的分子遺傳學(xué)因素尚未完全清楚，因此，從前列腺癌的發(fā)病機理出發(fā)，在分子水平對前列腺癌的發(fā)生發(fā)展進行研究，對于前列腺癌的診治及預(yù)防具有重要的意義。

病理學(xué)分級及臨床分期對前列腺癌的預(yù)后評價存在一定的局限性。腫瘤細(xì)胞的某些基因及其表達產(chǎn)物在腫瘤中的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等一系列病理過程中發(fā)揮著重要作用。癌基因激活和抑癌基因失活是各種腫瘤發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)。抑癌基因是一類抑制細(xì)胞增殖及癌變的基因，同時也是調(diào)節(jié)生長和分化的正?；颍职┗虻氖Щ顣?dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生。目前，對腫瘤抑制基因的研究是基因治療腫瘤的1個研究熱點。

多梳基因( polycomb group genes， PcG)家族作為核蛋白家族之一，在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中有著重要的作用[9]。Bmi-1是PcG家族中研究較多的蛋白之一，已在多種實體腫瘤中證實為原癌基因產(chǎn)物[10～12]，Bmi-1的過度表達與前列腺癌等腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移及進展密切相關(guān)[13，14]。Mel-18(PcG RING finger protein 2，PCGF2)，在N端區(qū)域為鋅指區(qū)域，該區(qū)域與Bmi-1相應(yīng)區(qū)域有93％同源性[15]。c-Myc位于染色體8q24，通過調(diào)控雄激素受體通路在前列腺癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著作用，Bmi-1與原癌基因c-Myc有協(xié)同致癌作用。有研究表明，Mel-18通過抑制Bmi-1及c-My發(fā)揮腫瘤抑制物的作用。最近的泛基因組分析表明，8q24，17q12，及17q24.3與前列腺癌相關(guān)[16,17]，Mel -18 位于染色體17q12，該區(qū)域通過基因連鎖和相關(guān)性檢驗證實與前列腺癌風(fēng)險存在相關(guān)性。最近研究表明，Mel -18是1種新的抑癌基因，有報道發(fā)現(xiàn)Mel -18 表達于正常乳腺組織，而在乳腺癌原代標(biāo)本中低表達或不表達。Lee等認(rèn)為增強乳腺癌細(xì)胞Mel -18 的表達，可降低乳腺癌細(xì)胞Akt/ PKB 的活性，通過INK4a/ARF基因抑制細(xì)胞周期進入增殖期，轉(zhuǎn)錄抑制原癌基因Bmi-1和c-Myc，從而發(fā)揮抵制腫瘤的作用[1～5]。

我們研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織中Mel-18 免疫組織化學(xué)染色分析表明，高分級的癌組織較低分級癌組織染色強度降低。陰性Mel-18的染色結(jié)果是伴生化復(fù)發(fā)或前列腺癌特異性生存的獨立預(yù)測因素。研究結(jié)果證實，Mel-18與前列腺癌進展為負(fù)相關(guān)，與上述文獻在其他腫瘤中的抑制作用一致，可能發(fā)揮著抑制前列腺癌進展的作用。

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