孔 靜,王昭萍**,于瑞海,張躍環(huán),劉 劍,李曉瑜,李雅琳,郭希明

(1.中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266003;2.青島嶗東海珍品良種培育有限公司,山東青島266105;3.Haskin Shellfish Research Laboratory,Institute of Marine and Coastal Sciences,Rutgers University,Port Norris,New Jersey 08349 USA)

貝類多倍體[1]的誘導(dǎo)主要是研究貝類三倍體。三倍體較二倍體具有絕對的生長優(yōu)勢,個(gè)體大且繁殖季節(jié)死亡率低。又因其性腺高度不育,在繁殖季節(jié),仍具有豐富的糖原,口感好,很受消費(fèi)者喜歡,具很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2]。三倍體貝類比正常貝類個(gè)體多一套染色體,不會對自然群體造成物種污染,既提高了貝類產(chǎn)量,增加經(jīng)濟(jì)價(jià)值,又為海產(chǎn)貝類育種提供了新的育種概念等,均是三倍體貝類的研究的重要原因。

以往研究從理化誘導(dǎo)和生物方法均獲得過貝類三倍體。就牡蠣多倍體的誘導(dǎo)而言,最先采用的就是化學(xué)誘導(dǎo)方法,Stanley等[3]最早采用不同濃度的細(xì)胞松弛素B處理美洲牡蠣(Crassostrea virginica)受精卵,得到8個(gè)月三倍體子代。之后長牡蠣(C.gigas)[4-7]、食用牡蠣(Ostrea edulis)[8]、悉尼巖牡蠣(Saccostrea commercialis)[9]和僧帽牡蠣(O.cucullata)[10]等牡蠣也成功誘導(dǎo)出三倍體。因理化誘導(dǎo)極易受外界因子如溫度、密度等的影響,三倍體誘導(dǎo)率無法達(dá)到100%,但生物雜交方法通過四倍體牡蠣和二倍體牡蠣雜交,可產(chǎn)生全三倍體牡蠣[11],前景較好[12]。

以往研究證明了雜交獲得三倍體的誘導(dǎo)率高,方法簡單,避免理化誘導(dǎo)對受精卵造成的影響,提高了孵化率和變態(tài)率[13],也初步證實(shí)了三倍體牡蠣的生長優(yōu)勢[11,24]。但如何利用不同地域的二倍體群體進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn),進(jìn)一步證實(shí)和提高雜交三倍體性狀,研究不多。本實(shí)驗(yàn)利用中國太平洋牡蠣自交、誘導(dǎo)及中國二倍體太平洋牡蠣與美國四倍體太平洋牡蠣雜交,對誘導(dǎo)獲得的三倍體群體及雜交獲得的三倍體,進(jìn)行生長發(fā)育比較來評估2種獲得三倍體的方法,為三倍體誘導(dǎo)方法的選擇及其今后的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 親貝的來源與促熟

中國太平洋牡蠣取自威海文登海區(qū)。美國四倍體太平洋牡蠣(雄)來自美國華盛頓州。親貝在嶗東海珍品培育有限公司育苗池網(wǎng)箱中暫養(yǎng)促熟。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方案 本試驗(yàn)采用3個(gè)試驗(yàn)組,分別為2NC、3NC、3N H;其中,2NC二倍體對照組:中國二倍體太平洋牡蠣自交組;3NC誘導(dǎo)三倍體群體組:中國二倍體太平洋牡蠣(2NC)雌♀×中國二倍體太平洋牡蠣(2NC)雄♂,再經(jīng)150μmol/L的6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)抑制受精卵第二極體的排放;3NH雜交三倍體組:中國二倍體太平洋牡蠣(2NC)雌♀×美國四倍體太平洋牡蠣(用4NA表示)雄♂。

1.2.2 受精 取性腺少量細(xì)胞,顯微鏡下鑒別雌雄,并檢查精卵的成熟狀況。雌雄牡蠣嚴(yán)格分開,以免精子污染。用解剖刀逐個(gè)刮取成熟性腺部,將卵用250目篩絹過濾后至標(biāo)記好的小桶中熟化1 h,舍棄上層卵液。受精前檢查卵子是否已經(jīng)受精,將獲得的精、卵按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)組合受精,迅速混合,攪拌均勻,于孵化桶中孵化。整個(gè)操作過程中,各實(shí)驗(yàn)組嚴(yán)格隔離,使其不受外來精、卵的影響。

1.3 幼蟲及稚貝的培育

受精卵經(jīng)24 h發(fā)育為D形幼蟲。選優(yōu)后,幼蟲培育密度設(shè)為8～10個(gè)/mL,培育水溫21℃,餌料每天投喂3次,前期為金藻,后期為扁藻與小球藻(1∶1)混合投喂。每天全量換水,為防止不同實(shí)驗(yàn)組幼蟲之間混雜,換水網(wǎng)箱單獨(dú)使用。定期調(diào)整密度,消除養(yǎng)殖密度對幼蟲生長的影響。

1.4 數(shù)據(jù)測量

(1)分別測量各組卵徑、卵裂率、D幼率和D形幼蟲大小。

(2)生長用殼高、殼長衡量。幼蟲階段每3 d測量1次;稚貝階段在40、70、110和140日齡測量。每次測量設(shè)3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)隨機(jī)測量30個(gè)個(gè)體。(3)測定浮游期各試驗(yàn)組幼蟲的存活率。

(4)測定各試驗(yàn)組倍性。幼蟲期取D形幼蟲以及在稚貝期取個(gè)體鰓組織,收集到1.5 m L離心管中,加入DAPI熒光染液1 m L,振蕩器震蕩0.5 min,用Partec PAⅡ流式細(xì)胞儀(FCM)進(jìn)行倍性檢測。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel作圖,SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理,不同試驗(yàn)組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析方法,差異顯著性設(shè)置為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 卵徑、卵裂率、D幼率、D形幼蟲大小及倍性

試驗(yàn)各組的卵徑、卵裂率、D幼率、D形幼蟲大小及三倍體誘導(dǎo)率見表1。3個(gè)試驗(yàn)組在卵徑和卵裂率方面均無顯著性差異(P>0.05),雜交三倍體的D形幼蟲規(guī)格顯著大于誘導(dǎo)群體組和二倍體自交組(P<0.05)。但在D幼率上看,3N H組個(gè)體顯著高于3NC群體組(P<0.05),與對照二倍體組無顯著差異(P>0.05)。在三倍體誘導(dǎo)率方面,雜交獲得的三倍體率為100%,明顯高于誘導(dǎo)群體組獲得的三倍體倍化率。

表1 誘導(dǎo)三倍體群體與雜交三倍體卵徑、卵裂率、D幼率、D形幼蟲大小及倍性測定的比較Table 1 Comparison of egg-diameter,cleavage rate,hatching rate,D larval size and ploidy for trip loid Pacific oyster by hybridized and induced

2.2 浮游期幼蟲存活率

圖1 誘導(dǎo)三倍體群體與雜交三倍體幼蟲存活比較Fig.1 Survival rates of trip loid Pacific oysters by hybridized and induced

將D形幼蟲的存活率定義為100%,由各試驗(yàn)組存活曲線(見圖1)可以看出,隨著幼蟲日齡的增長,各組幼蟲的存活率下降,且各試驗(yàn)組的存活率變化不同。3日齡時(shí),2NC和3N H組存活率彼此間無顯著差異(P>0.05),但顯著高于3NC群體(P<0.05);6～15日齡期間,各試驗(yàn)組的幼蟲存活率順次為3NH>2NC>3NC群體,且各組間差異顯著(P<0.05)。

2.3 雜交三倍體與誘導(dǎo)三倍體群體生長比較

2.3.1 幼蟲的生長 各試驗(yàn)組幼蟲的生長曲線如圖2。3組的殼高生長速度分別為2NC組(13.73±0.98)μm/d,3NC群體組(15.80±0.83)μm/d和3NH組(16.41±0.61)μm/d。9日齡以前,各試驗(yàn)組幼蟲的大小彼此間無顯著差異;9～18日齡期間,3NH組殼高生長速度最快,表現(xiàn)出明顯的生長優(yōu)勢。整個(gè)幼蟲浮游期間,從幼蟲的生長速度上看:3NH組>3NC群體組>2NC組,且3組間差異均顯著(P<0.05)。

圖2 誘導(dǎo)三倍體群體與雜交三倍體幼蟲生長比較Fig.2 Shell height of trip loid Pacific oysters by hybridized and induced

圖3 誘導(dǎo)三倍體群體與雜交三倍體稚貝殼高的生長比較Fig.3 Shell height of juvenile of triploid Pacific oysters by hybridized and induced

圖4 誘導(dǎo)三倍體群體與雜交三倍體稚貝殼長的生長比較Fig.4 Shell length of juvenile of triploid Pacific oysters by hybridized and induced

2.3.2 稚貝的生長 各試驗(yàn)組稚貝期殼高和殼長的生長曲線如圖3、4。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,3組殼長和殼高均保持相同的增長趨勢。稚貝期3組的殼高生長速度分別是2NC組(0.151±0.025)mm/d,3NC群體組(0.179±0.028)mm/d和3NH組(0.230±0.065)mm/d;殼長的生長速度分別是2NC組(0.099±0.010)mm/d,3NC群體組(0.110±0.016)mm/d和3NH組(0.132±0.031)mm/d。稚貝期各試驗(yàn)組殼高、殼長的生長速度:3NH>3NC群體>2NC,且彼此間的生長速度差異顯著(P<0.05)。

2.4 稚貝期三倍體群體中二倍體和三倍體與雜交三倍體生長比較

在稚貝期(110日齡)對誘導(dǎo)三倍體群進(jìn)行了倍性檢測,并對分離出的三倍體和二倍體以及雜交三倍體進(jìn)行了生長測量,殼高和殼長的生長情況如表2。結(jié)果表明,到110日齡的稚貝期,誘導(dǎo)群體中的三倍體在殼高和殼長2方面稍小于雜交三倍體,但無明顯差異(P>0.05),而誘導(dǎo)群體中的二倍體則比二倍體對照組生長快,尤其殼高明顯大于對照組。

表2 稚貝期(110日齡)三倍體群體中二倍體和三倍體與雜交三倍體生長性狀比較Table 2 Comparison of shell length and shell height of juvenile of dip loid and trip loid Pacific oyster by hybridized and induced(Day 110)/mm

3 討論

本實(shí)驗(yàn)所選6-二甲氨基嘌呤誘導(dǎo)三倍體的方法是因?yàn)?-二甲氨基嘌呤作為誘導(dǎo)劑,誘導(dǎo)率高,毒性小,操作方便,價(jià)格便宜[14],現(xiàn)已被廣泛采用。

雜交、誘導(dǎo)2種方法獲得的三倍體卵裂率高,生長速度快,D形幼蟲大小均大于二倍體對照組,但D形幼蟲率很低。尤其是誘導(dǎo)獲得的三倍體群體組D形幼蟲率低,由于6-DMAP的影響,使得牡蠣幼蟲出現(xiàn)畸形,該組死亡率在前期迅速下降。但雜交三倍體組存活率很穩(wěn)定。應(yīng)與化學(xué)誘導(dǎo)劑對受精卵產(chǎn)生的影響有關(guān),這與田傳遠(yuǎn)等[15]結(jié)果一致。12日齡以后,各組均出現(xiàn)幼蟲大量沉底現(xiàn)象,闕華勇等[13]雜交多倍體實(shí)驗(yàn)中也有類似現(xiàn)象出現(xiàn)。與對照組相比,雜交三倍體和誘導(dǎo)三倍體群體從浮游幼蟲階段就表現(xiàn)出生長優(yōu)勢,此結(jié)果與王昭萍等[16]結(jié)論一致。從三倍體率來看,雜交獲得100%的三倍體,較誘導(dǎo)群體組誘導(dǎo)率高且穩(wěn)定。

通過對誘導(dǎo)三倍體群體和雜交三倍體的對比,從卵裂率、D幼率、存活率、生長發(fā)育和倍性等方面均體現(xiàn)了雜交三倍體具有優(yōu)勢。在稚貝期將誘導(dǎo)三倍體群體中的三倍體與雜交三倍體進(jìn)行生長比較,雜交三倍體稍大于前者,但是差異不顯著,這與王昭萍等[27]結(jié)果相吻合。分析本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)三倍體群體與雜交三倍體之間的生長差異原因可能有2個(gè):一是在誘導(dǎo)三倍體群體中二倍體含量過高,降低了三倍體的實(shí)際生長水平;二是雜交三倍體是中美牡蠣雜交,即為兩種不同地理群體雜交,表現(xiàn)出了雜種優(yōu)勢。而誘導(dǎo)群體中的二倍體則比二倍體對照組生長快,可能是誘導(dǎo)群體中的二倍體經(jīng)過了藥物處理所致。

雜交獲得三倍體即為誘導(dǎo)多倍體方法中的生物方法,該方法簡單易操作,三倍體率高達(dá)100%,避免了理化處理對胚胎發(fā)育和環(huán)境的影響。這同陶抵輝、于瑞海等[17]觀點(diǎn)一致。此結(jié)果同時(shí)也驗(yàn)證了雜交三倍體在生產(chǎn)應(yīng)用上的可行性,同先前的于瑞海等[18]研究結(jié)果一致。

雜交獲得三倍體的方法具有很多優(yōu)點(diǎn),但雜交方法中的四倍體親本的獲得是該方法的關(guān)鍵,也是瓶頸。雖有很多種養(yǎng)殖牡蠣[8,19-21]進(jìn)行四倍體誘導(dǎo),但目前只有太平洋牡蠣、美洲牡蠣和近江牡蠣建立了穩(wěn)定的四倍體群系[22-24]。故四倍體的研究仍是多倍體方面需要繼續(xù)探索的一個(gè)方向。

闕華勇等進(jìn)行了四倍體太平洋牡蠣(G)和二倍體近江牡蠣(A)的雜交試驗(yàn)[25]。種間雜交子代GGA組幼蟲個(gè)體較GA組大,眼點(diǎn)幼蟲形成也在GA組之前。同時(shí)證實(shí)了雜交三倍體兼具了兩親本的特性,如適鹽范圍變寬了。而本實(shí)驗(yàn)兩親本太平洋牡蠣分別來自于中國威海和美國華盛頓,為種內(nèi)雜交三倍體子代。種內(nèi)雜交,是目前雜種優(yōu)勢利用的主要途徑[26]。本實(shí)驗(yàn)并未對子代的生理等進(jìn)行試驗(yàn),不能確定是否兼具不同地理群體兩親本的優(yōu)勢,是本實(shí)驗(yàn)需要繼續(xù)研究的一個(gè)方向。

牡蠣作為水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類之一,本實(shí)驗(yàn)通過對雜交三倍體和誘導(dǎo)三倍體群體的生長狀況具體比較,驗(yàn)證雜交的方法獲得的全三倍體,提高了牡蠣生產(chǎn)的產(chǎn)量,存活率也很高,適合在生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用,是加速貝類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展的一個(gè)可行的重要方向。

致謝:感謝青島亞特蘭生物科技有限公司提供四倍體牡蠣親貝;青島嶗東海珍品良種培育有限公司郭希瑞、馬強(qiáng)、孫軍委等對本試驗(yàn)的幫助。

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