徐后國(guó),艾慶輝,麥康森,徐 瑋,劉付志國(guó)

(中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266003)

枯草芽孢桿菌是我國(guó)農(nóng)業(yè)部正式批準(zhǔn)使用的益生菌,具有菌種單一、不產(chǎn)生耐藥性、無(wú)毒性等特點(diǎn),作為益生菌亦具有耐酸、耐鹽、耐高溫及耐擠壓等特性,適合在飼料中添加使用?？莶菅堪麠U菌在動(dòng)物腸道內(nèi)代謝、增殖,可以調(diào)節(jié)腸道菌群、提高機(jī)體消化能力、增強(qiáng)免疫力和抗病力[1-5]。甲殼素是廣泛分布于節(jié)肢動(dòng)物外殼、菌類及藻類細(xì)胞中的1種類纖維素天然高分子物質(zhì)。殼聚糖為甲殼素脫乙?；幚砗蟮漠a(chǎn)物,是1種堿性多糖,生物兼容性好,且具有生物降解,無(wú)毒等特性。殼寡糖是殼聚糖降解以后聚合度為2～10的產(chǎn)物,其水溶性好,容易被吸收利用,且生物活性比殼聚糖更強(qiáng)。甲殼素或殼聚糖提高水產(chǎn)動(dòng)物免疫力和抗病力的功能已得到廣泛的證實(shí)[6-12]。殼寡糖抗氧化[13-14]、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[15-18]、促進(jìn)腸道菌群增殖[19]等作用雖然已被大量研究證實(shí),然而,其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究卻幾乎沒(méi)有。

大黃魚(yú)屬鱸形目,石首魚(yú)科,黃魚(yú)屬,是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類。隨著大黃魚(yú)高密度集約化養(yǎng)殖的逐漸展開(kāi),大黃魚(yú)的病害情況也日益嚴(yán)重,而鑒于傳統(tǒng)藥物對(duì)食品安全和環(huán)境的危害,開(kāi)發(fā)高效安全的新型免疫增強(qiáng)劑成為當(dāng)務(wù)之急。本實(shí)驗(yàn)的目的是通過(guò)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)探求枯草芽胞桿菌和殼寡糖對(duì)大黃魚(yú)幼魚(yú)非特定性免疫力的影響,為大黃魚(yú)高效環(huán)保配合飼料的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料制作

以魚(yú)粉(粗蛋白,69.7%;粗脂肪,7.1%)、豆粕(粗蛋白,53.3%;粗脂肪,1.9%)為蛋白源,魚(yú)油、大豆油和卵磷脂為脂肪源,小麥粉為糖源,并添加維生素混合物(mg or g/kg diet:維生素B1,25 mg;核黃素,45 mg;維生素B6,20 mg;維生素B12,0.1 mg;維生素K3,10 mg;肌醇,800 mg;維生素B3,60 mg;煙酸,200 mg;葉酸,20 mg;生物素1.20 mg;維生素A,32 mg;維生素D3,5 mg;維生素E,120 mg;維生素C,2 000 mg;氯化膽堿,2 500 mg;乙氧基喹啉,150 mg;小麥粉,18.52 g)、無(wú)機(jī)鹽混合物(mg or g/kg diet:氟化鈉,2 mg;碘化鉀,0.8 mg;1%氯化鈷,50 mg;硫酸銅,10 mg;硫酸鐵,80 mg;硫酸鋅,50 mg;硫酸錳,60 mg;硫酸鎂,1 200 m g;磷酸二氫鈣,3 000 mg;氯化鈉,100 mg;沸石粉,15.45 g)、誘食劑(甘氨酸+甜菜堿)、防霉劑(50%丙酸鈣+50%富馬酸)配制成基礎(chǔ)飼料(見(jiàn)表1)。

采用2×3雙因素設(shè)計(jì),分別在基礎(chǔ)飼料中添加0(B0)(對(duì)照)、0.1%(B1)和0.2%(B2)的芽孢桿菌制劑(主要成分枯草芽孢桿菌1×1010cfu/g,青島瑪斯特生物技術(shù)有限公司),每個(gè)芽孢桿菌水平添加0.0%(C0)(對(duì)照)、0.3%(C1)和0.6%(C2)的殼寡糖(脫乙酰度95%,分子量2000,純度95.48%,中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院),配制出9種等氮等能的實(shí)驗(yàn)飼料:C0B0,C0B1,C0B2,C1B0,C1B1,C1B2,C2B0,C2B1和C2B2。在飼料制作過(guò)程中,所有原料粉碎后過(guò)320μm篩網(wǎng),各原料按配比定量后混合均勻,然后加入適量的水揉勻,經(jīng)F(Ⅱ)-26型雙螺桿擠條機(jī)(華南理工大學(xué),廣州)加工制成硬顆粒飼料(1.5 mm×2.0 mm,2.5 mm×3.0 mm),55℃烘干至飼料水分含量為10%左右,用塑料袋包裝,保存于-15℃冰柜中備用。經(jīng)測(cè)定枯草芽孢桿菌制粒損失率為2/3,則最終枯草芽孢桿菌的添加梯度為:0.0、0.5×107和1.0×107cfu/g。

表1 實(shí)驗(yàn)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)成分組成Table 1 Formulation and p roximate composition of the experimental diets(%dry matter)

1.2 實(shí)驗(yàn)魚(yú)的來(lái)源、馴化與養(yǎng)殖管理

實(shí)驗(yàn)在浙江省寧波市象山縣西滬港進(jìn)行。大黃魚(yú)選用象山海灣育苗場(chǎng)當(dāng)年繁育的同一批魚(yú)苗。在開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)前,幼魚(yú)放于海水大網(wǎng)箱(3.0 m×3.0 m×3.0 m)中暫養(yǎng)2周,并以實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)飼料(Diet 1)飽食投喂,使之逐漸適應(yīng)實(shí)驗(yàn)飼料和養(yǎng)殖環(huán)境。

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí),實(shí)驗(yàn)魚(yú)饑餓24 h,然后稱質(zhì)量,并挑選出規(guī)格一致(平均初始體質(zhì)量為(7.82±0.68)g)的大黃魚(yú)進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)在27個(gè)浮式海水網(wǎng)箱(1.0 m×1.0 m×1.5 m)中進(jìn)行,放養(yǎng)密度為60尾/箱。每一網(wǎng)箱為一組,每種飼料隨機(jī)投喂3組實(shí)驗(yàn)魚(yú)。每天飽食投喂2次(05··00和17··00)。養(yǎng)殖周期70 d。每天記錄投飼量,如有死魚(yú)記錄數(shù)量并稱質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)期間海水水溫為22.5～31.5℃,鹽度為28～33,溶解氧含量在6 mg·L-1左右。

1.3 樣品收集

70 d生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,對(duì)實(shí)驗(yàn)魚(yú)饑餓24 h,分別從每網(wǎng)箱抽取5尾魚(yú),以無(wú)菌注射器自尾靜脈取血,室溫沉降2 h,然后4℃沉降4～6 h,分離血清并保存于-70℃冰箱。

1.4 免疫學(xué)指標(biāo)的測(cè)定

1.4.1 血清溶菌酶活力 血清中溶菌酶活力通過(guò)濁度比色法測(cè)定[20]。反應(yīng)底物為用磷酸緩沖溶液(0.05 mol·L-1、p H=6.1)配制的0.2 m g·m L-1微壁溶球菌(Sigma)懸液。100μL血清與1 900μL菌懸液混合,在530 nm波長(zhǎng)下,分別在0.5和4.5 min測(cè)定吸光值(OD)?；盍挝欢x為每分鐘吸光值減少0.001所需的血清量。

1.4.2 血清替代途徑補(bǔ)體活力 血清中替代途徑補(bǔ)體活力參考Yano[21]的方法測(cè)定。將100μL兔血紅細(xì)胞(RaRBc)懸液(每毫升緩沖溶液含有2×108個(gè)細(xì)胞)加到250μL用緩沖溶液系列稀釋的魚(yú)血清中。不斷搖動(dòng),26℃反應(yīng)90 min。反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入3.15mL冷的生理鹽水,然后離心5 min(3 000 r/min)。血清的溶血程度通過(guò)用分光光度計(jì)在414 nm測(cè)定上清液的吸光值?；盍挝欢x為使RaRBC發(fā)生50%溶解的血清量。

1.4.3 血清SOD活力 血清SOD活性使用南京建成試劑盒測(cè)定?；驹硎?通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子(O-2),O-2氧化羥胺形成亞硝酸鹽,在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色,用可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)其吸光值。當(dāng)被測(cè)樣品中含SOD時(shí),則對(duì)超氧陰離子有專一性的抑制作用,使形成的亞硝酸鹽減少,比色時(shí)測(cè)定管的吸光值低于對(duì)照管的吸光值,通過(guò)測(cè)定O-2被抑制的多少來(lái)確定SOD值的大小。血清中SOD酶活力單位定義為:每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)到50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)SOD酶活單位(U)。

1.4.4 血清CA T活力 血清CA T活性使用南京建成試劑盒測(cè)定。基本原理是:過(guò)氧化氫酶分解H2O2的反應(yīng)可以通過(guò)加入鉬酸銨而迅速中止,剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生1種淡黃色的絡(luò)合物,在405 nm處測(cè)定其生成量,可計(jì)算出CA T的活力。每毫升血清每秒鐘分解1μmol H2O2的量為1個(gè)活力單位(U)。

1.5 計(jì)算及統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 11.5 for Window s對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,若差異達(dá)到顯著,則進(jìn)行Tukey多重比較,顯著性水平為P<0.05。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 飼料中添加枯草芽孢桿菌和殼寡糖對(duì)血清溶菌酶活力的影響(見(jiàn)表2)

在每1個(gè)枯草芽孢桿菌添加水平,飼料中添加殼寡糖顯著提高了大黃魚(yú)幼魚(yú)的血清溶菌酶活力(P<0.05),而血清溶菌酶活力在添加殼寡糖的兩處理間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。在每個(gè)殼寡糖水平,飼料中枯草芽孢桿菌的添加提高了大黃魚(yú)血清溶菌酶活力,但是血清溶菌酶活力在各枯草芽孢桿菌的添加水平差異不顯著(P>0.05)。血清溶菌酶活力在添加0.6%殼寡糖+0.5×107cfu/g枯草芽孢桿菌的處理組達(dá)到最大值?？莶菅挎邨U菌和殼寡糖對(duì)溶菌酶活力的影響沒(méi)有顯著的交互作用(P>0.05)。

表2 飼料中添加枯草芽孢桿菌和殼寡糖對(duì)大黃魚(yú)幼魚(yú)血清免疫指標(biāo)的影響Table 2 Effects of dietary supplementation with Bacillus subtilis and chito-oligosaccharide on serum immunological parameters of juvenile large yellow croaker(Pseudosciaena crocea)fed experimental diets for 70days(Means±S.E.M.)/m l-1

2.2 飼料中添加枯草芽孢桿菌和殼寡糖對(duì)血清替代途徑補(bǔ)體活力的影響(見(jiàn)表2)

大黃魚(yú)幼魚(yú)的血清替代途徑補(bǔ)體活力在各處理組間均沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。殼寡糖和枯草芽孢桿菌對(duì)血清替代途徑補(bǔ)體活力的影響也沒(méi)有顯著的交互作用(P>0.05)。

2.3 飼料中添加枯草芽孢桿菌和殼寡糖對(duì)血清超氧化物歧化酶(SOD)的影響(見(jiàn)表2)

在每個(gè)枯草芽孢桿菌水平,飼料中添加殼寡糖提高了大黃魚(yú)血清SOD活力,但是SOD活力在添加殼寡糖的處理組和未添加殼寡糖的處理組間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。在每個(gè)殼寡糖水平,飼料中枯草芽孢桿菌的添加水平?jīng)]有對(duì)大黃魚(yú)血清SOD活力造成顯著性影響。大黃魚(yú)血清SOD值在添加0.3%殼寡糖+0枯草芽孢桿菌的處理組達(dá)到最大值。殼寡糖和枯草芽孢桿菌對(duì)血清SOD活力的影響沒(méi)有顯著的交互作用(P>0.05)。

2.4 飼料中添加枯草芽孢桿菌和殼寡糖對(duì)血清過(guò)氧化氫酶(CA T)的影響(見(jiàn)表2)

大黃魚(yú)幼魚(yú)的CA T活力在各處理組間均沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。殼寡糖和枯草芽孢桿菌對(duì)血清CA T活力的影響也沒(méi)有顯著的交互作用(P>0.05)。

3 討論

3.1 枯草芽孢桿菌的益生作用

枯草芽抱桿菌在動(dòng)物腸道內(nèi)能大量消耗氧氣,形成腸道厭氧環(huán)境,扶持和促進(jìn)雙岐桿菌、乳酸菌等有益菌的增殖,同時(shí),枯草芽孢桿菌還具有刺激動(dòng)物免疫系統(tǒng)提高免疫力等作用?？莶菅挎邨U菌提高動(dòng)物免疫機(jī)能的功能已經(jīng)在金頭鯛[22]、鯉[3,5]、羅非魚(yú)[4]及甲殼動(dòng)物[23-24]上進(jìn)行的大量研究中得到證實(shí)。Kumar等[5]研究表明,飼料中添加1.5×107/g枯草芽孢桿菌能顯著提高鯉的巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)能力,促進(jìn)非特異性免疫力的提高。A ly等[4]在羅非魚(yú)的研究中也證實(shí)飼料中添加107/g枯草芽孢桿菌顯著提高了羅非魚(yú)血液嗜中性粒細(xì)胞黏附力及血漿溶菌酶活力。

然而,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻表明,飼料中添加枯草芽孢桿菌并未對(duì)大黃魚(yú)幼魚(yú)血清免疫指標(biāo)產(chǎn)生顯著性影響。分析其原因,枯草芽孢桿菌沒(méi)有對(duì)大黃魚(yú)免疫反應(yīng)產(chǎn)生顯著性影響可能是因?yàn)闅す烟堑奶砑硬坏珱](méi)有對(duì)枯草芽孢桿菌的益生作用產(chǎn)生促進(jìn),反而對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)揮益生作用產(chǎn)生了抑制。因?yàn)闅す?聚)糖具有廣譜的抗菌活性,其分子中帶有的游離氨基容極易結(jié)合氫離子而使殼寡(聚)糖分子帶正電荷,它可以吸附在菌體表面形成1層高分子膜阻止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)向細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸[25],或者吸附細(xì)菌表面帶陰離子的物質(zhì)或鞭毛莢膜等結(jié)構(gòu)物質(zhì)而干擾細(xì)菌的正常代謝,小分子量的殼寡糖分子甚至可以滲透進(jìn)入到細(xì)菌體內(nèi)吸附陰離子物質(zhì),干擾細(xì)胞代謝。

3.2 殼寡糖的益生作用

本實(shí)驗(yàn)中,飼料中殼寡糖的添加顯著提高了大黃魚(yú)血清溶菌酶水平,表明殼寡糖對(duì)海水魚(yú)的非特異性免疫力具有一定的提高作用。目前,關(guān)于甲殼素或殼聚糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物免疫力的影響已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究[7-12,26],證明甲殼素或殼聚糖能提高水產(chǎn)動(dòng)物的呼吸爆發(fā)活性和溶菌酶活性,提高機(jī)體免疫力。Han等[16]也發(fā)現(xiàn)飼料中添加0.1%～0.3%的殼寡糖能促進(jìn)豬淋巴細(xì)胞的增殖及抗體生成。同時(shí),一些體外實(shí)驗(yàn)及浸泡實(shí)驗(yàn)同樣證明了殼寡(聚)糖的免疫促進(jìn)功能[6,8,15,27]。

本實(shí)驗(yàn)中,飼料中殼寡糖的添加未對(duì)大黃魚(yú)血清的血清替代途徑補(bǔ)體活力、超氧化物歧化酶活力及過(guò)氧化氫酶活力產(chǎn)生顯著性影響,這可能是由于不同的免疫指標(biāo)對(duì)同一種免疫刺激物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生不同的反應(yīng)或產(chǎn)生反應(yīng)的時(shí)間不同,也可能與實(shí)驗(yàn)用殼寡糖的聚合度、脫乙酰度、添加量及試驗(yàn)魚(yú)的種類有關(guān)。

3.3 枯草芽孢桿菌與殼寡糖的交互作用

殼寡糖的益生元作用已經(jīng)得到證明,Lee等[19]的實(shí)驗(yàn)證明,聚合度在2～8的殼寡糖可以有效促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸菌的增殖。同時(shí)添加枯草芽孢桿菌和殼寡糖用于動(dòng)物飼料的實(shí)驗(yàn)還未有過(guò)報(bào)道。華雪銘等[28]研究發(fā)現(xiàn)同時(shí)在飼料中添加殼聚糖和益生菌對(duì)暗紋東方魨的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。本實(shí)驗(yàn)中,也并未觀察到枯草芽孢桿菌與殼寡糖的交互作用,其原因可能如上所述,殼寡糖具有抗菌活性,由于殼寡(聚)糖分子帶正電荷,分子中帶有的游離氨基可以與細(xì)胞表面帶陰離子的物質(zhì)或鞭毛莢膜等結(jié)構(gòu)物質(zhì)發(fā)生吸附,阻礙細(xì)菌正常代謝,或者結(jié)合氫離子在細(xì)菌表面形成1層高分子膜,阻止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)向細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸,小分子的殼寡糖還可以通過(guò)滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部與細(xì)胞內(nèi)部帶陰離子的物質(zhì)發(fā)生吸附,干擾細(xì)菌細(xì)胞的正常代謝。所以,本實(shí)驗(yàn)飼料中殼寡糖的添加可能會(huì)極大地抑制枯草芽孢桿菌作用的發(fā)揮。No等[29]在研究不同分子量殼寡(聚)糖對(duì)豆腐產(chǎn)品中腐生細(xì)菌的抑制作用時(shí)也發(fā)現(xiàn)不同分子量的殼寡(聚)糖對(duì)豆腐產(chǎn)品腐生細(xì)菌中的一些芽孢桿菌產(chǎn)生了不同程度的抑制作用。而本實(shí)驗(yàn)中,飼料中添加的殼寡糖對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用可能過(guò)于嚴(yán)重,以致毀滅性地大黃魚(yú)幼魚(yú)血清免疫指標(biāo)的影響大黃魚(yú)幼魚(yú)血清免疫指標(biāo)的影響。

[1] Rengpipat S,Phianphak W,Piyatiratitivorakul S,et al.Effects of a probiotic bacterium on black tiger shrimp Penaeus monodon survival and grow th[J].Aquaculture,1998,167:301-313.

[2] Vaseeharan B,Ramasamy P.Control of pathogenic Vibrio spp.by Bacillus subtilis BT23,a possible probiotic treatment for black tiger shrimp Penaeus monodon[J].Lett Appl Microbiol,2003,36:83-87.

[3] Nayak S K,Swain P,Mukherjee S C.Effect of dietary supplementation of probiotic and vitamin Con the immune response of Indian major carp,Labeorohita(Ham.)[J].Fish Shellfish Immunol,2007,23:892-896.

[4] Aly SM,Ahmed Y A,Ghareeb A A,et al.Studies on Bacillus subtilis and Lactobacillus acidophilus,as potential probiotics,on the immune response and resistance of Tilapia nilotica(Oreochrom is niloticus)to chalenge infections[J].Fish Shellfish Immunol,2008,25:128-136.

[5] Kumar R,Mukherjee SC,Ranjan R,et al.Enhanced innate immune parameters in Labeorohita(Ham.)following oral administration of Bacillussubtilis[J].Fish Shellfish Immunol,2008,24:168-172.

[6] Anderson D P,Siwicki A K.Duration of p rotection against Aeromonas salmonicida in brook trout immunostimulated with glucan or chitosan by injection or immersion[J].Pro Fish Cult,1994,56:258-261.

[7] Kolman H,Siwicki A K,Kolman R.The effect of natural immunodulators applied is immersion on non-specific immune responses in Russian sturgeon(Acipenser gueldenstadeti Brand t)[J].Arch RybPol,1998,6(2):391-410.

[8] Esteban M A,Mulero V,Cuesta A,et al.Effects of injecting chitin particles on the innate immune response of gilthead seabream(Sparus aurata L.)[J].Fish Shelf Immunol,2000,10:543-555.

[9] Esteban M A,Mulero V,Cuesta A,et al.Immunomodulatory effects of dietary intake of chitin on gilthead seabream(Sparus aurata L.)innate immune system[J].Fish Shellfish Immunol,2001,11:303-315.

[10] Wang S H,Chen JC.The protective effect of chitin and chitosan against Vibrio alginolyticus in white shrimp Litopenaeus vannamei[J].Fish Shellfish Immunol,2005,19:191-204.

[11] Gopalakannan A,A rul V.Immunomodulatory effects of dietary intake of chitin,chitosan and levamisoleon the immune system of Cyprinus carpio and control of Aeromonas hydrophila infection in ponds[J].Aquaculture,2006,255:179-187.

[12] Cha S H,Lee J S,Song CB,et al.Effects of chitosan-coated diet on improving water quality and innate immunity in the olive flounder,Paralichthys olivaceus[J].Aquaculture,2008,278(1-4):110-118.

[13] Sun T,Yao Q,Zhou D,et al.Antioxidant activity of N-carboxy methyl chitosan oligosaccharides[J].Bioorg Med Chem Lett,2008,18(21):5774-5776.

[14] Anraku M,Fujii T,Furutani N,et al.Antioxidant effects of a dietary supplement:Reduction of indices of oxidative stress in normal subjects by water-soluble chitosan[J].Food Chem Toxicol,2009,47(1):104-109.

[15] Wu G J,Tsai GJ.Chitooligosaccharides in combination with interferon-gamma increase nitric oxide production via nuclear factor-kappa Bactivation in murine RAW 264.7 macrophages[J].Food Chem Toxicol,2007,45(2):250-258.

[16] Han K N,Yang Y X,Hahn T W,et al.Effects of chito-oligosaccharides supplementation on performance,nutrient digestibility,pork quality and immune response in growing-finishing pigs[J].J Anim Feed Sci,2007,16:607-620.

[17] Li X J,Piao X S,Kim SW,et al.Effects of chito-oligosaccharide supplementation on performance,nutrient digestibility,and serum composition in broiler chickens[J].Poul Sci,2007,86:1107-1114.

[18] Chen Y J,Kim IH,Cho J H,et al.Effects of chitooligo saccharide supplementation on grow th performance,nutrient digestibility,blood characteristics and immune responses after lipopolysaccharide challenge in weanling pigs[J].Liv Sci,2009,124(1):255-260.

[19] Lee H W,Park Y S,Jung J S,et al.Chitosan oligosaccharides,dp 2-8,have p rebiotic effect on the Bifidobacterium bifidium and Lactobacillus sp[J].Anaerobe,2002,8(6):319-324.

[20] Ellis A E.Lysozyme assays[M].∥Techniques in Fish Immunology.Fair Haven,N J:SOS Publications,1990:101-103.

[21] Yano,T.Assays of Hemolytic Complement Activity.∥:Techniques in Fish Immunology[M].N J:SOS Publications,Fair Haven,1992,131-141.

[22] Salinas I,Cuesta A,Esteban M A,et al.Dietary administration of Lactobacillus delbrueckii and Bacillus subtilis,single or combined,on gilthead seabream cellular innate immune responses[J].Fish Shellfish Immunol,2005,19:67-77.

[23] 謝佳磊,肖丹,殷蝶,等.枯草芽孢桿菌對(duì)克氏原螯蝦免疫機(jī)能的影響[J].淡水漁業(yè),2007,37(6):24-28.

[24] 朱學(xué)芝,鄭石軒,潘慶軍,等.芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫和生化指標(biāo)的影響[J].飼料研究,2007(4):56-59.

[25] Helander IM,Nurmiaho-Lassila E-L,Ahvenainen R,et al.Chitosan disrupts the barrier properties of the outer membrane of Gram-negative bacteria[J].Int J Food Microbiol,2001,71(2-3):35-244.

[26] Kono M,Matsui T,Shimizu C.Effects of chitin,chitosan and cellulose as diet supplements on the grow th of cultured fish[J].Nippon Suisan Gakkaishi,1987,53:125-129.

[27] Cuesta A,Esteban M A,Meseguer J.In vitro effect of chitin particles on the innate cellular immune system of gilthead seabream(Sparus aurata L.)[J].Fish Shellfish Immunol,2003,15:1-11.

[28] 華雪銘,周洪琪,張宇峰,等.飼料中添加殼聚糖和益生茵對(duì)暗紋東方純幼魚(yú)生長(zhǎng)及部分消化酶活性的影響[J].水生生物學(xué)報(bào),2007,29(3):299-305.

[29] No H K,Park N Y,Lee S H,et al.Antibacterial activities of chitosans and chitosan oligomers with different molecular weights on spoilage bacteria isolated from tofu[J].J Food Sci,2002,67(4):1511-1514.