曹紅, 楊金鳳, 單麗娜, 曹麗梅, 李 靜

(石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,新疆石河子 832000)

新疆沙棘果實中總黃酮超聲輔助提取工藝研究

曹紅, 楊金鳳, 單麗娜, 曹麗梅, 李 靜

(石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,新疆石河子 832000)

研究了超聲輔助提取新疆沙棘果實中的總黃酮。建立并運用三波長分光光度法測定沙棘總黃酮的含量;采用正交試驗方法確定沙棘果實總黃酮的超聲輔助提取最佳條件。最佳工藝參數(shù)是超聲波功率為150W(超聲波頻率為20 k Hz),提取劑乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為60%,料液比為1∶20(g∶mL),溫度為65℃,超聲處理時間40 min,提取次數(shù)為2次。相同提取條件下,與傳統(tǒng)的熱回流提取法相比,超聲輔助提取法總黃酮得率提高了0.73%。

新疆沙棘果實;總黃酮;超聲輔助提取;三波長分光光度法

沙棘(Hippophae rhamnoidesL.),又名醋柳,胡禿子科(Elaeagnaceae)沙棘屬落葉灌木或小喬木。沙棘果實中富含多種生物活性物質(zhì),其中黃酮類化合物是沙棘中非常重要的生物活性成分,具有清除體內(nèi)的自由基、抗氧化、抗衰老、防治心血管疾病、抗腫瘤及增強免疫力、抗輻射等醫(yī)藥保健功效[1-6],此外,在植物資源中,沙棘具有重要的生態(tài)功能。沙棘根蘗繁殖,根系發(fā)達,能夠有效地防止水土流失和防風(fēng)固沙。沙棘的根系寄生根瘤菌,能固定游離氮素,而且根能將不溶性的有機物和礦物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇艿臓顟B(tài),有利于改良土壤。因此,沙棘是西部生態(tài)治理的優(yōu)選植物。

在中國,天然生長的沙棘有4個種5個亞種,新疆天然分布的沙棘是沙棘的2個亞種,即蒙古沙棘亞種和中亞沙棘亞種。目前對新疆沙棘的研究,中國國內(nèi)報道得不多。本文為了有效消除干擾組分的吸收光譜具有線性吸收和吸收峰不對稱給定量分析造成的影響,首先建立三波長分光光度法測定沙棘果實中總黃酮含量,然后探討采用超聲輔助乙醇溶液提取新疆沙棘果實中總黃酮,優(yōu)選最佳工藝條件,為全面研究和開發(fā)新疆的優(yōu)勢沙棘資源提供科學(xué)依據(jù)和方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

沙棘果實(中亞沙棘,H.rhamnoidesL.subspturkestanica Rousi in.Ann.):新疆和田產(chǎn),蘆丁對照品:中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品;其余試劑均為AR級試劑。

1.2 主要儀器

Lab Tech Blue Star紫外/可見分光光度計:美國萊伯泰科公司生產(chǎn);BS2000S電子天平:賽多利斯儀器有限公司生產(chǎn);KQ5200型超聲儀:昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)。

1.3 三波長分光光度法

1.3.1 三波長的確定方法 準(zhǔn)確移取0.2 mg/m L蘆丁對照品溶液1.00 mL注入10 mL容量瓶中,加1 g/dL的三氯化鋁溶液,充分混勻,定容,用1 cm的比色皿在波長200～600 nm范圍內(nèi)掃描,繪制出其吸收曲線,并用作圖法確定3個測定波長λ1、λ2和λ3。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法 分別精密移取0.60、0.80、1.00、1.20、1.40 和 1.60 m L 的 0.2 mg/mL蘆丁對照品溶液,置于10 m L容量瓶中,加入1 g/dL的三氯化鋁溶液至刻度,充分混勻。用1 cm的比色皿分別在選定的3波長處測定其吸光度,參照文獻[7-9]報道方法計算ΔA,以ΔA對濃度C進行線性回歸。

1.3.3 精密度和回收率計算 精密移取已準(zhǔn)確測知含量的供試品溶液5 m L,分別加入0.50、1.00、1.50 m L 0.1 mg/m L蘆丁對照品溶液,按照1.3.2項下方法分別重復(fù)測定3份,計算其總黃酮含量。

1.4 實驗方法

1.4.1 沙棘果實處理 將沙棘果實在60℃烘箱中烘干至恒重,粉碎后過60目篩備用。

1.4.2 超聲提取 準(zhǔn)確稱取一定量沙棘果實粉碎物,按一定料液比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇,在一定溫度下經(jīng)超聲提取一定時間后,過濾,濾渣在同樣條件下可再繼續(xù)提取,合并濾液,測定其總黃酮的含量,3次重復(fù)。

先采用單因素試驗分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取料液比、超聲波功率(超聲波頻率為20 k Hz)、超聲處理時間、提取溫度和提取次數(shù)對提取效果的影響。然后根據(jù)單因素實驗結(jié)果,采用L9(34)正交試驗考察最佳提取純化工藝,因素水平見表1。

表1 正交試驗因素及水平Tab.1 Factors and levels of the orthogonal experiment

1.4.3 傳統(tǒng)熱回流提取 提取溫度除外,其余均采用正交試驗優(yōu)選的最佳條件,利用傳統(tǒng)加熱回流方法提取沙棘果實粉碎物中的總黃酮,并測定其含量,3次重復(fù)。

1.5 總黃酮得率計算

根據(jù)線性回歸方程計算提取液的含量,再計算沙棘果實中總黃酮提取得率。公式如下:

其中:n為提取液稀釋倍數(shù);m為提取液中總黃酮的質(zhì)量(g);M為沙棘果實的質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 三波長分光光度法的建立

2.1.1 三波長的確定 用作圖法確定出3個測定波長分別為λ1=495 nm,λ2=415 nm,λ3=368 nm。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照文獻[3-4]報道方法計算ΔA,并以ΔA對濃度C進行線性回歸,得回歸方程為ΔA=1.995 7C+0.006 2,r=0.999 6。

2.1.3 精密度和回收率 該測定方法的回收率為95.7%～101.9%,平均回收率為 97.8%;精密度(RSD)為0.7～2.4%,平均精密度(RSD)為1.4%,說明測定方法的準(zhǔn)確度和精密度均較高。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮得率的影響 準(zhǔn)確稱取沙棘果實粉碎物5份,每份約10 g,按照料液比1∶20(g∶m L)加入體積分?jǐn)?shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%乙醇 ,在 20k Hz、150W 功率下 ,分別室溫超聲處理30 min,考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮得率影響(見圖1)。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

從圖1可知,在乙醇體積分?jǐn)?shù)小于60%時,總黃酮得率隨溶劑體積分?jǐn)?shù)增大而增大,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過60%以后略呈下降趨勢,說明乙醇體積分?jǐn)?shù)過高或過低提取率都不利。這是由于不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇極性不同,黃酮類化合物具有中等偏上的極性。

2.2.2 不同料液比對總黃酮得率的的影響 稱量沙棘果實粉碎物5份,每份約10 g,以體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇為提取劑,料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25(g∶m L)條件下,在 20 k Hz、150 W功率下,分別室溫超聲處理30 min,考察不同料液比對提取效果的影響(見圖2)。

圖2 料液比對總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

圖2顯示,料液比越高,總黃酮得率越高,當(dāng)料液比達到1∶20(g∶m L)的時候,得率趨于穩(wěn)定,若繼續(xù)增加料液比,對總黃酮得率影響逐漸減小。

2.2.3 超聲波功率的影響 稱量沙棘果實粉碎物5份,每份約10 g,以體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇為提取劑,料液比為 1∶20(g∶m L),超聲波頻率為20k Hz 條件下 ,分別在 100、125、150、175、200 W 功率下,室溫超聲處理30 min,考察不同超聲功率對提取效果的影響(見圖3)。

圖3 超聲波功率對總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of total flavonoids

由圖3可見,超聲波功率在<150 W時,沙棘總黃酮得率隨著功率的增大而增加,在>150 W,提取率隨著功率的增加反而減少。這可能是由于超聲功率越低,超聲產(chǎn)生的機械作用越弱,而功率過高時,產(chǎn)生的空化效應(yīng)弱,有效成分的溶出不充分。在空化作用與機械作用的最佳結(jié)合點上,有效成分溶出最完全,總黃酮得率最大。因而確定150W為適宜的提取功率。

2.2.4 超聲波處理時間的影響 準(zhǔn)確稱取沙棘果實粉碎物5份,每份約10 g,按照料液比1∶20(g∶m L)加入體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇,在20k Hz、150W功率下 ,分別室溫超聲處理 10、20、30、40、50 min,考察超聲處理時間對總黃酮得率的影響(見圖4)。

圖4 超聲處理時間對總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic processing time on the extraction rate of total flavonoids

圖4表明,隨著提取時間的增加,總黃酮得率呈上升趨勢,但在40 min之后,總黃酮得率隨著提取時間的增加而呈下降趨勢。造成總黃酮得率下降的原因可能是在長時間超聲作用下,有效成分發(fā)生降解,致使提取率降低。因而確定40 min為適宜的提取時間。

2.2.5 提取溫度對總黃酮得率的影響 準(zhǔn)確稱取沙棘果實粉碎物5份,每份約10 g,按照料液比1∶20(g∶m L)加入體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇,在20k Hz、150W 功率下 ,分別在溫度為 40、50、60、70、80 ℃條件下超聲處理30 min后,考察溫度對總黃酮得率得影響(見圖5)。

圖5 提取溫度對總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids

由圖5可以看出,隨著提取溫度的增加,總黃酮得率呈上升趨勢,當(dāng)溫度達到70℃后,總黃酮得率隨溫度的增加而趨于穩(wěn)定。并且溫度升高和加熱時間的延長,提取液得顏色會逐漸的加深,黃酮類物質(zhì)會被氧化。因此,提取溫度不易太高。

2.2.6 提取次數(shù)對提取效果的影響 稱量沙棘果實粉碎物5份,每份約10 g,按照料液比1∶20(g∶m L)加入體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇,在20k Hz、150W功率下 ,分別室溫超聲處理 1、2、3、4、5 次 (每次 30 min),考察提取次數(shù)對提取效果的影響(圖6)。

圖6 提取次數(shù)對總黃酮得率的影響Fig.6 Effect of the repeated extraction times on the extraction rate of total flavonoids

由圖6可見,隨提取次數(shù)的增加,總黃酮的得率也在增加,且逐漸趨于穩(wěn)定,繼續(xù)增加提取次數(shù),對總黃酮得率的影響很小。

2.3 沙棘果實中總黃酮超聲輔助提取工藝優(yōu)化正交試驗

在上述單因素試驗的基礎(chǔ)上,將正交因素實驗提取時間固定為40 min、超聲波功率固定為150W(超聲波頻率為20 k Hz)。為了綜合考察乙醇濃度、提取溫度、料液比和提取次數(shù)對總黃酮提取率的影響,選用L9(34)進行正交試驗(見表1、表2)。

表2 正交試驗結(jié)果Tab.2 The result of the orthogonal experiment

表3 方差分析Tab.3 Analysis of varianc

正交試驗極差及方差分析結(jié)果表明,各因素對總黃酮提取的影響次序為:料液比(C)>乙醇的體積分?jǐn)?shù)(A)>提取次數(shù)(D)>提取溫度(B)。從正交表中總黃酮得率比較分析,可以直觀的判斷的最優(yōu)工藝是:A2B2C3D1,得率為1.71%;而從正交表中不同水平總黃酮得率累加值K的比較分析得到最佳提取條件是A2B2C3D2;方差分析結(jié)果表明料液比(C)為高度顯著性因素,乙醇的濃度(A)為一般顯著性因素,其它因素均不顯著,從降低能耗、減少試劑消耗、縮短提取時間考慮,最佳的工藝為:A2B1C3D1?？紤]到提取效率和成本的問題,則選定最優(yōu)工藝為A2B1C3D1。

2.4 精密度測定

稱量沙棘果實粉碎物5份,每份約10 g,在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,料液比1∶20(g∶m L),溫度65℃,超聲波功率150 W(超聲波頻率為20 kHz),提取時間40 m in條件下超聲輔助連續(xù)提取2次,測定提取率分別為:1.65%、1.71%、1.68%、1.70%、1.72%,平均為1.69%,RSD為1.65%,提示該提取工藝方法比較穩(wěn)定。

2.5 超聲波輔助提取與傳統(tǒng)熱回流提取的比較

分別采用超聲輔助提取和傳統(tǒng)熱回流提取法提取沙棘果實中的總黃酮,結(jié)果顯示超聲輔助提取法總黃酮得率為1.67%,傳統(tǒng)熱回流提取法總黃酮得率為0.94%。即超聲輔助提取法總黃酮得率提高了0.73%。

3 結(jié) 語

通過上述對沙棘黃酮類化合物超聲輔助提取工藝的研究,得到以下結(jié)論:

1)天然產(chǎn)物中總黃酮含量常采用分光光度法進行監(jiān)測和評價。一般常用的分光光度法存在一定缺陷,加入鋁鹽使黃酮類化合物與鋁離子形成穩(wěn)定的配合物,則吸收帶Ⅰ會明顯產(chǎn)生紅移,同時吸光度也大大增加,但干擾成分會使吸收峰不對稱,給定量分析造成一定的影響[3]。為了有效消除干擾組分的吸收光譜具有線性吸收和吸收峰不對稱給定量分析造成的影響,本文建立了三波長分光光度法測定沙棘總黃酮含量。實驗結(jié)果表明,三波長法準(zhǔn)確度、精密度均較高。

2)在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行正交試驗,充分考慮到工作效率和成本的問題,優(yōu)選沙棘總黃酮的最佳提取工藝:超聲波功率200W(超聲波頻率為20 k Hz),乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為60%,料液比為1∶20(g∶m L),溫度65 ℃,超聲處理時間40 min,提取次數(shù)2次。

3)超聲波輔助提取法與回流提取法的比較試驗顯示,超聲輔助提取法具有提取速度快,溶劑用量相對較少,能有效避免因高溫帶來的有效成分損失,處理簡單等優(yōu)點,所以從經(jīng)濟效益上來說,超聲波提取也是一種較好的工藝方法。

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Study on Extraction Technology of Total Flavonoids from Xinjiang Seabuckthorn Fruit by Ultrasonic-assisted Method

CAO Hong, YANG Jin-feng, SHAN Li-na, CAO Li-mei, Li Jing
(Chemistry and Chemical Engineering College,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

In this study,the the extraction process of total flavonoids from in the Xinjiang Sea buckthorn fruit was developed.Total flavonoids in sea buckthorn was determined by three wavelength spectrophotometry.The extraction conditions of total flavonoids in seabucktho rn was optimized by orthogonal experiment and the results listed as as follow s:ultrasonic power of 150 W(ultrasonic waves frequency of 20 k Hz),ethanol concentration of 60%,solid-liquid ratio of 1∶20(g∶m L),temperature of 65 ℃,ultrasonic extraction time of 40 min,extracting for 2 times.With this optimum conditions,the yield of ultrasound-assisted extraction process increased 0.73%than that of the conventional heating backstreaming process.

Xinjiang seabuck thorn fruit,total flavonoids,ultrasound-assisted extraction,three wavelength spectrophotometry

S 38

A

1673-1689(2011)03-0348-05

2010-05-12

兵團應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃博士基金專項項目(2009JC13)。

＊

曹紅(1969-),女,安徽廬江人,醫(yī)學(xué)博士,副教授,主要從事食品與藥物分析及生物催化與酶工程等方面的研究。Email:chyf_ch@sina.com