姜恒,許建中,侯天勇

(1.成都醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院輸血教研室,四川 成都 610083;2.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院骨科,重慶 400038)

臨床上用抗生素治療慢性骨髓炎時(shí)由于骨感染后局部失血管化和/或生物被膜的形成,致使藥物在體內(nèi)病灶擴(kuò)散和滲透發(fā)生障礙,全身用藥即使達(dá)到毒性劑量也不能確保足夠的局部有效治療濃度,因此尋找有效治療途徑對(duì)治療慢性骨髓炎非常關(guān)鍵。從全身用藥到局部使用慶大霉素骨水泥鏈珠,直至最近生物可降解、合成可降解的藥物緩釋技術(shù),讓我們看到治療慢性骨髓炎新的希望。

在各種緩釋材料系統(tǒng)中,天然聚合物材料由于其價(jià)格低廉、來(lái)源廣泛、安全無(wú)毒并利于環(huán)保,對(duì)其開發(fā)利用也更富有吸引力,其中海藻酸鈉、殼聚糖等多糖類材料因具有極好的生物相容性和生物可降解性,有條件成為良好的給藥載體而得到廣泛的研究[1-4]。海藻酸是存在于褐藻類中的一類天然多糖,是β-D-甘露糖醛酸(簡(jiǎn)稱M)和α-L-古洛糖醛酸(簡(jiǎn)稱G)通過(1-4)糖苷鍵連接形成的一類線形無(wú)分枝的鏈狀陰離子聚合物,其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為 G型結(jié)構(gòu)如扣帶彎曲而M型結(jié)構(gòu)呈帶狀伸展,所以 G型結(jié)構(gòu)與鹽離子結(jié)合易形成凝膠,而M型結(jié)構(gòu)與鹽離子結(jié)合易形成溶膠[5-10]。

海藻酸鹽種類繁多,其結(jié)構(gòu)不同可影響理化和生物學(xué)特性[11-17]。海藻酸鈉的相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)緩釋作用的影響較大,其相對(duì)分子質(zhì)量與釋藥速度之間有良好的線性關(guān)系,海藻酸鈉的相對(duì)分子質(zhì)量越大,黏度越大,釋藥速度越慢。海藻酸鈉作為緩釋制劑的載體,M/G值影響緩釋作用。Akihiko等研究相對(duì)分子質(zhì)量較小模型藥物的結(jié)果顯示,M/G值越大,釋放速度越快。

因此,本研究利用海藻酸鈉不同類型的特殊理化性質(zhì),根據(jù)Hou T前期試驗(yàn)工作結(jié)果,對(duì)藻酸鹽萬(wàn)古霉素微球進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)中選取了高 G型、分子量較大、粘滯度較高的藻酸鹽包裹萬(wàn)古霉素與氯化鈣交聯(lián)形成復(fù)合微球,并考察其相關(guān)指標(biāo)的優(yōu)化情況,從中篩選出較理想的品種,以便深入進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)工作。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

藻酸鹽(Sigma):A2158為低粘度、低 G型, A0682為低粘度、低G型,A2033為高粘度、低 G型(代號(hào) H型),A71238為低粘度、高 G型(代號(hào) G型)。萬(wàn)古霉素:標(biāo)準(zhǔn)品V2002(Sigma),實(shí)驗(yàn)用品為穩(wěn)可信(注射用鹽酸萬(wàn)古霉素,Eli Lilly Japan K. K.)。氯化鈣:分析純,中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司。

1.2 主要儀器和設(shè)備

臺(tái)式離心機(jī)(Sigma);BP211D型電子天平(德國(guó)Sartorius公司);420A+PH計(jì)(美國(guó) ThermoO-rion公司);D400型立式電熱蒸汽消毒器(上海翔運(yùn)醫(yī)用設(shè)備廠);79-1型磁力熱攪機(jī)(江陰科研器械廠);高效液相色譜儀(Waters 510泵,484紫外檢測(cè)器);冷凍干燥機(jī)(Savant Modulyo);游標(biāo)卡尺(TESA 0.02 mm,陜西威爾機(jī)電科技有限公司)。

1.3 方法

分別稱取上述各類一定質(zhì)量的藻酸鹽溶解于去離子水中,分別配制成2%、4%、8%、10%、12%和16%溶液,分別與等體積的50 mg/mL和30 mg/ mL的萬(wàn)古霉素溶液混合,攪拌10 min后,形成均一粘稠的溶液,用注射器抽取后,裝上直徑1.2 mm的注射器針頭,加壓后使藻酸鹽萬(wàn)古霉素混合溶液緩慢滴入到攪動(dòng)的1.01%氯化鈣水溶液中。10 min后,將從氯化鈣水溶液中收集的藻酸鹽微球用去離子水洗凈后,-70℃凍存6 h后再低壓凍干6～8 h直至重量不再變化,分裝保存。Sartorius天平(精度0.1 mg)稱取大致相同質(zhì)量的由不同濃度藻酸鹽和萬(wàn)古霉素溶液制備的微球,加入到5 mL的5%檸檬酸三鈉溶液中,放置在37℃的100 rpm搖床上裂解微球1 h。收集裂解液以 10 000 rpm離心10 min,取上清液在高效液相色譜儀上測(cè)定萬(wàn)古霉素濃度。萬(wàn)古霉素含量(%)=微球中萬(wàn)古霉素質(zhì)量/藻酸鹽微球的質(zhì)量×100%。計(jì)算包封率:α=MV/ MA+MV,M理=M樣＊α,EE=M實(shí)/M理(其中MV為制作微球時(shí)萬(wàn)古霉素總量,MA包被材料總量,M樣是抽樣檢測(cè)微球總量,M理是抽樣檢測(cè)微球所含萬(wàn)古霉素理論值,M實(shí)為抽樣檢測(cè)微球裂解后的離心上清液通過高效液相色譜儀所測(cè)得萬(wàn)古霉素實(shí)際含量)。再將G、H型按質(zhì)量比例1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1分別配制成不同濃度溶液,重復(fù)上述方法進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)對(duì)各組凍干微球用游標(biāo)卡尺進(jìn)行粒徑粗略測(cè)定。

2 結(jié)果

由表1可見,通過初篩,高 G高粘度的海藻酸鈉隨著濃度增加可明顯提高包封率。

表1 不同種類、不同濃度海藻酸鈉包封率初步比較Tab.1 Comparison of encapsulation rates of multiple concentrations and kinds of alginate sodium

3 討論

Hou T前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),用纖維蛋白凝膠包裹的藻酸鹽微球緩釋系統(tǒng)結(jié)合組織工程骨聯(lián)合移植,可使局部組織獲得長(zhǎng)達(dá)21 d的有效抗菌時(shí)間,其遠(yuǎn)期的成骨情況良好,未見緩釋系統(tǒng)對(duì)于成骨的不良影響。使用纖維蛋白凝膠藻酸鹽包裹藥物微球包封率有限(20.36±0.90%),制作萬(wàn)古霉素藻酸鹽緩釋微球顆粒較大(3 mm),投藥量多,在動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)成骨延遲現(xiàn)象,表明微球顆粒占位影響成骨[18-19]。本研究就這兩方面進(jìn)行優(yōu)化探討,以便為進(jìn)一步優(yōu)化復(fù)合材料和動(dòng)物體內(nèi)骨組織工程實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備。

研究發(fā)現(xiàn):①不同種類不同濃度海藻酸鈉包封率初步比較,高G、高粘度的海藻酸鈉隨著濃度增加可明顯提高包封率。隨著粘度、濃度增加,微球顆粒大小增加不明顯;②由于條件限制,高粘度、高 G隨濃度增加,梯度滴注制作微球會(huì)增加難度,甚至人力達(dá)不到(＜16%就很難產(chǎn)出球)。因此需要將高粘度、高G材料配比優(yōu)化,也可降低濃度制作微球,抑或用機(jī)械化方法制作,使生產(chǎn)過程可靠、可控、可重復(fù);③圖1說明所測(cè)數(shù)據(jù)差別較大,總趨勢(shì)顯示G∶H(2∶1)包封率優(yōu)化結(jié)果較好。數(shù)據(jù)差別較大的原因推測(cè)可能為微球顆粒大小差異造成,在圖1結(jié)果的基礎(chǔ)上固定每組顆粒數(shù),并保證組內(nèi)相近總質(zhì)量的情況下達(dá)到較好一致性而得到圖2,圖2顯示顆粒直徑大小與各組微球包封率大小數(shù)值無(wú)關(guān),數(shù)據(jù)差別仍然大。圖1、2還顯示A2158微球組穩(wěn)定性較好,其他組號(hào)穩(wěn)定性較差,說明存在微球不均勻性。

根據(jù)上述結(jié)果,需要改進(jìn)的問題有:①藥物在材料中的濃度不均一,今后在制作凝膠微球工藝方面有待進(jìn)一步提高;②微球穩(wěn)定性,文獻(xiàn)報(bào)道微球在氯化鈣溶液中孵育交聯(lián)時(shí)間越長(zhǎng),微球穩(wěn)定性能增強(qiáng);③微球與殼聚糖復(fù)合后也能使微球更加穩(wěn)定,但其復(fù)合時(shí)間是關(guān)鍵,需要試驗(yàn)摸索;④制作工藝中,藥物與材料混合過程中產(chǎn)生的氣泡是不可忽視的影響因素,需要對(duì)其抽氣處理。

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