于治國

（巢湖職業(yè)技術學院，安徽 巢湖 238000）

山茶花提取物預處理對腦缺血再灌注損傷的保護作用

于治國

（巢湖職業(yè)技術學院，安徽 巢湖 238000）

目的：探討山茶花提取物（extract of Camellia japonica L,ECJ）預處理對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及其機制。方法：采用大腦中動脈線栓法制作小鼠大腦中動脈閉塞（MCAO）模型，觀察ECJ預處理對小鼠大腦中動脈栓塞再灌注后腦梗死體積、血清小鼠神經特異性烯醇化酶（NSE）的活性及丙二醛（MDA）含量的變化。結果：與模型組對比，ECJ（15mg.kg-1，30mg.kg-1，60mg.kg-1）預處理明顯減少腦梗塞體積，并可顯著降低血清中NSE和MDA含量。結論：山茶花提取物預處理對小鼠腦缺血再灌注損傷具有明顯的保護作用。

山茶花提取物；腦缺血再灌注性損傷；藥物預處理；小鼠

腦缺血再灌注損傷是急性腦血管病發(fā)生與發(fā)展中重要的病理生理基礎。缺血預處理（Ischemic preconditioning，IP）最早是由Murry[1]等在犬心肌缺血模型中發(fā)現(xiàn)的，經典缺血預處理的概念是指短暫的缺血再灌注能使心肌在隨后的長時程缺血再灌注中得到保護，減少心梗面積和缺血再灌注損傷，。Kitagawa等證實該現(xiàn)象同樣存在于大腦，隨后更多的實驗證實了缺血耐受的器官的普遍性[2]。藥物預處理（pharmacological preconditioning，PP）正是IP基礎上提出來的。山茶花提取物（ECJ）是一種黃酮類物質，以往的研究發(fā)現(xiàn)ECJ對局灶性腦缺血再灌注性損傷具有良好的保護作用[3，4]。而山茶花提取物預處理（pharmacological precongtioning ofECJ）對小鼠腦缺血再灌注損傷的影響機制未見明確的報道，因此，本研究就山茶花提取物預處理對小鼠腦缺血再灌注損傷的影響及其機制進行了研究。

1.材料

1.1 藥品與試劑 ECJ：是用乙醇提取法提取山茶花中的有效成分，實驗前用生理鹽水配成所需濃度；尼莫地平注射液（nimodipine,Nim）山東方明股份有限公司出品；TTC（氯化三苯四唑啉 2，3，5-triphenyl tetrazaliumchloride,TTC），丙二醛（MDA），小鼠神經特異性烯醇化酶（NSE）測試盒均由南京建成生物研究所。

1.2 動物 昆明種小鼠，♀♂兼用，體重20-25g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：皖醫(yī)實動準第02號。

2.方法

2.1 動物分組：70只昆明種小鼠隨機分成7組，每組10只，♀♂各半。模型組（MODEL）：大腦中動脈（MCA）線栓阻斷血流 60min，再灌注 24h；缺血預處理組（IP）：MCA線栓缺血5min后灌注5min，再缺血5min灌注30min，隨后缺血60min,再灌注 24h；ECJ 三個不同劑量組（15，30，60mg.kg-1）：持續(xù)5min靜脈推注不同劑量ECJ，停止給藥5min，再次持續(xù)靜脈給藥5min，30min后阻斷MCA血流60min,再灌注24h;尼莫地平組（2 mg.kg-1）：給藥及實驗程序同ECJ組；假手術組：只手術但不阻斷MCA。

2.2 動物模型制作：參照Longa[5]線栓法制作小鼠大腦中動脈栓塞（MCAO）模型。4%水合氯醛（100 mg·kg-1）腹腔注

射麻醉小鼠后，分離右側頸總、頸內及頸外動脈并結扎頸外動脈，在頸內、頸外分叉處剪一小口，將頭端燒光滑的漁線插入至MCA起始部，進線深度約為14mm±1mm。實驗結束后留取血清和腦，放入-20℃冰箱中冷凍保存，待測血清中NSE、MDA的含量。腦放入-20℃冰箱中速凍15min后制成2mm厚的冠狀切片，置于2%TTC磷酸緩沖液中37℃避光恒溫孵育30分鐘，10%甲醛固定，根據(jù)梗死腦組織不著色，正常腦組織著深紅色的原理，數(shù)碼相機拍照后利用圖象分析軟件測量腦梗死面積。缺血灶體積=∑（An.T），An為各腦片上的缺血灶面積，T為每片腦片的厚度；同樣的方法計算整個腦片的體積。計算缺血部分體積占全腦的體積的百分比[6]

3.統(tǒng)計方法 實驗數(shù)據(jù)均以x±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。

4.結果

4.1 ECJ預處理對小鼠腦梗死體積的影響

見表1,模型組小鼠腦梗死體積顯著高于假手術組（P＜0.01）。與 IP 組一樣，ECJ預處理在 30 mg·kg-1，60 mg·kg-1可降低MCAO致小鼠腦組織梗死體積百分比的升高。預處理Nim也有類似的結果。

4.2 ECJ預處理對小鼠血清中MDA、NSE影響

表1 ECJ預處理對腦缺血小鼠腦梗死體積的影響（x±s，n=8）

見表2,與假手術組比較，模型組血清中MDA及NSE含量均有顯著升高（P＜0.01）。IP和Nim預處理可顯著降低血清中 MDA及 NSE 的增高（P＜0.01），在 30 mg·kg-1，60mg·kg-1劑量，ECJ預處理亦可明顯降低血清中NSE和MDA含量的升高。

表2 ECJ預處理對小鼠血清中MDA及NSE含量的影響（x±s，n=8）

5.討論

眾多的研究表明一次或多次短暫缺血后,可提高腦組織對隨后較長時間缺血及再灌注的耐受力,是機體的一種內源性保護機制[7,8,9]。缺血再灌注損傷與氧自由基的生成有密切關系。MDA是脂質過氧化的共同產物，細胞中MDA的量?？煞磻獧C體內的脂質過氧化的程度，間接反映腦細胞受自由基攻擊的嚴重程度和細胞損傷的程度，因此MDA是評價腦缺血再灌注損傷的較好指標之一[9]。

烯醇化酶是糖糖酵解中酶-烯醇化酶的同工酶，普遍存在于生物體細胞漿中，共有5種同工酶。NSE是特異存在于腦神經細胞和神經內分泌細胞的胞漿中，腦組織缺血、缺氧、壞死，神經元細胞膜的完整性發(fā)生變化，NSE從細胞內漏至血漿中，引起血漿內濃度增高，故血清中NSE含量的改變可作為中樞神經系統(tǒng)損傷較特異和靈敏的指標。

本研究發(fā)現(xiàn)小鼠 MCAO后，腦梗死面積、血清中NSE活性以及自由基代謝產物MDA明顯增多，而ECJ預處理與IP類似可顯著降了腦梗死面積、血清中的NSE以及MDA的含量。

綜上所述，ECJ預處理對小鼠腦缺血再灌注損傷有明顯的保護作用，其機制可能與抑制脂質過氧化有關。

[1]Murry CE，Jennings RB，Reimer KA.Preconditioningwith ischemia：a delayof lethal cell injury in ischemic myocardium［J］．Circulation,1986,74（5）：1124-1132.

[2]Kitagawa K,Matsumoto M,Oda T,et al.Free radical generation during brief of cerebral ischemia trigger delayed neuronal death[J].Stroke,1990,35（3）：551-558.

[3]尹明華，洪森榮，邵興華.山茶花提取物對腦缺血再灌注小鼠學習記憶損傷的改善作用[J].中國行為醫(yī)學科學，2007,16（12）：1070-1071.

[4]羅勝勇，董六一，范麗，方明，陳志武.山茶花總黃酮對缺血性腦損傷的保護作用[J].中國臨床藥理學與治療學，2004，8（10）：1157-1159.

[5]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]．Stroke，1989，20：80-91．

[6]Yi Yang,Ashfaq Shuaib,Qiu Li.Quantification of infarct size on focal cerebral ischemia model of rats using a simple and economical method[J].Journal of Neuroscience Methods,1998,84（2）：9-16.

[7]Nadashima M，Niwa M，Twai T，et al.Involvement of free radicals in cerebral vascular reperfusion injury evaluated in a transient focal cerebral sichemia model of rat[J]．Free Radical Biol Med，1999,25（6）：722-729．

[8]Moncayo J, de Freitas GR,Bogousslavsky J,et al．Do transient ischemic attacks have a neuroprotective effect[J].Nerology，2000，54（11）：2089-2094.

[9]Abas F,Alkan T,Goren B,et al.Neuroprotective effects of postconditioning on lipid peroxidation and apoptosis after focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats[J].Turk Neurosurg,2010 20（1）：1-8.

R961 < class="emphasis_bold">文獻標識碼：A

A

1671-752X（2011）04-0035-02

2011-08-22

于治國（1979-），男，安徽巢湖人，巢湖職業(yè)技術學院醫(yī)學分院助理實驗師。

夏萬夫）