圖 雅 張海燕

（內(nèi)蒙古呼和浩特市疾病預(yù)防控制中心，呼和浩特 010070）

HPLC法測定豬肝中阿苯達唑殘留量的測量不確定度評價

圖 雅*張海燕

（內(nèi)蒙古呼和浩特市疾病預(yù)防控制中心，呼和浩特 010070）

建立了HPLC法分析豬肝中阿苯達唑殘留量測定結(jié)果的不確定度數(shù)學(xué)模型，對測定過程中的不確定度來源進行逐層分析和合成。分析結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)品的配制、稀釋及試驗過程中隨機效應(yīng)引入的不確定度分量是影響阿苯達唑殘留量測定結(jié)果不確定度的主要因素。

高效液相色譜法；不確定度；阿苯達唑；豬肝

不確定度評定是中國合格評定國家認可委員會評定檢測實驗室測量水平的重要指標(biāo)，也是判斷檢測結(jié)果質(zhì)量的依據(jù)。合理地評定測量結(jié)果的不確定度對實驗室間比對、實驗室的質(zhì)量控制及方法的確認等方面都具有重要的意義。本研究對用HPLC法測定豬肝中阿苯達唑的結(jié)果進行了不確定評估，并對影響不確定度因素進行了分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Varian Prostar240高效液相色譜儀，紫外檢測器。阿苯達唑標(biāo)準(zhǔn)品：德國Dr.Ehrenstofer公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

精密稱取10.0 mg阿苯達唑，用甲醇溶解并定容至100.00 mL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)中間工作液的配制

準(zhǔn)確吸取阿苯達唑儲備液1.0 mL至100 mL容量瓶中，用流動相稀釋定容。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

分別吸取0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL、4.00 mL標(biāo)準(zhǔn)中間液，用流動相稀釋定容至10.00 mL。質(zhì)量濃度分別為 0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.40μg/mL。

1.3 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取樣品5.0 g置于50 mL離心管中，加入20 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩5 min，8 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入50 mL雞心瓶中。再向離心管中加入20 mL乙酸乙酯，渦旋離心，重復(fù)提取一次，合并上清液，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。向雞心瓶加入2 mL乙腈，超聲3 min，加入5 mL正己烷溶解殘渣，轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，4 000 r/min離心5 min，棄去正己烷層。下層提取液過強陽離子固相萃取小柱凈化，50℃氮氣吹干，準(zhǔn)確加入2.00mL流動相溶解殘渣，過微孔濾膜，上HPLC分析。

1.4 色譜條件

色譜柱：AgilentXDBC18柱（4.6mm×250mm）；柱溫：室溫；

流動相：0.05 mol/mL乙酸銨溶液（pH=5） +乙腈+質(zhì)量分數(shù)1%甲酸溶液，梯度洗脫；

流速：1.0 mL/min；

檢測波長：292 nm；

進樣量：50 μL。

2 數(shù)學(xué)模型

式中：X——樣品中阿苯達唑質(zhì)量分數(shù)，μg/kg；

C0——定溶液中阿苯達唑質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——定容體積，mL；

fRec——回收率校正因子；

fran——隨機效應(yīng)校正因子；

m——樣品取樣量，g。

樣品中阿苯達唑質(zhì)量分數(shù)為：

3 不確定度的來源分析

從試驗過程和數(shù)學(xué)模型分析，阿苯達唑殘留量測量的不確定度主要來源可歸納為以下幾方面：

a） 試樣處理液中阿苯達唑含量測定值C0引入的不確定度：主要是擬合標(biāo)準(zhǔn)溶液-峰面積曲線校準(zhǔn)得出C0產(chǎn)生的不確定度和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量配制稀釋時所引入的不確定度，后者主要包含標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度ua；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量產(chǎn)生的不確定度ub；標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程使用的玻璃量器校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度uc及標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過程溫度變化引入的不確定度ud。

b） 樣品稱量m引入的不確定度。

c） 體積V引入的不確定度。

d） 樣品前處理對樣品回收率的影響引入的不確定度。

e） 測試過程隨機效應(yīng)引入的不確定度。

4 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的量化

根據(jù)不確定度來源分析對各分量分別進行不確定度評價。

4.1 樣液中阿苯達唑殘留量的測定值C0引入的不確定度

4.1.1 校準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度

為校準(zhǔn)高效液相色譜儀，采用對阿苯達唑標(biāo)準(zhǔn)濃度系列進行2次重復(fù)測定，得到峰面積y，用最小二乘法擬合得到直線方程y=bx+a（a為截距，b為斜率）。測定結(jié)果見表1。

表1 校準(zhǔn)曲線擬合數(shù)據(jù)

由最小二乘法得到擬合直線的斜率b和截距a分別為：

阿苯達唑標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積測量值的標(biāo)準(zhǔn)偏差S為：

應(yīng)用該校準(zhǔn)曲線進行測量時，對樣液進行2次測量（即p=2），測得樣液中阿苯達唑的含量為0.195 μg/mL，則擬合校準(zhǔn)曲線產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（C0）為：

4.1.2 配制阿苯達唑標(biāo)準(zhǔn)工作液引入的不確定度

4.1.2.1 由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

根據(jù)阿苯達唑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書提供的信息，阿苯達唑的相對擴展不確定度為0.5%，并指明包含因子k=2，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.1.2.2 稱量阿苯達唑產(chǎn)生的不確定度

阿苯達唑稱樣量為10.00 mg，根據(jù)天平檢定證書給出的信息，其質(zhì)量允差為0.10 mg，取正態(tài)分布，則稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.1.2.3 阿苯達唑標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程量器校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度

阿苯達唑標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程中使用了一系列玻璃量具，根據(jù)《常用玻璃量具檢定規(guī)程JJG196-1990》提供的信息，各量器均有相應(yīng)的最大允差，按照矩形分布考慮，由此估算各分量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中量具引入的不確定度

由表2數(shù)據(jù)的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

4.1.2.4 阿苯達唑標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程中溫度變化引入的不確定度

由于實驗室環(huán)境的溫度缺乏控制而產(chǎn)生的不確定度。該不確定度可通過估算環(huán)境溫度變化范圍和液體的體積膨脹系數(shù)進行估算。溫度變化范圍為±4℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，按矩形分布考慮，由溫度變化引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量見表3。

由表3數(shù)據(jù)的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量配制稀釋時產(chǎn)生的不確定度的合成

表3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中溫度變化引入的不確定度

由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、稱量、溫度變化和量具校準(zhǔn)所產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.2 樣品稱量引入的不確定度

用萬分之一天平，其分度值為0.1 mg，稱樣品5 g，取矩形分布，引入的不確定度為：

4.3 樣品處理后定容體積引入的不確定度

樣品經(jīng)萃取、凈化、氮氣吹干后，用2 mL的單線標(biāo)吸管取2.00 mL流動相溶解并定容。2 mL單線標(biāo)吸管引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定包含校準(zhǔn)引入的不確定度和溫度變化引起的不確定度。

根據(jù)證書其最大允許差為±0.015 mL，取均勻分布，引入的不確定度為：

根據(jù)制造商提供的信息，所用量具已在20℃校準(zhǔn)，而實驗室的溫度在±4℃之間變動，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，按矩形分布考慮，由溫度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.4 萃取、凈化過程對樣品回收率的影響

萃取、凈化過程對樣品回收率的影響所產(chǎn)生的不確定度應(yīng)根據(jù)6次樣品添加回收率的相關(guān)數(shù)據(jù)進行計算。6次阿苯達唑回收率的測定結(jié)果分別為：87.1%、86.2%、87.1%、84.9%、87.1%、84.9%，平均回收率Rec為86.2%，標(biāo)準(zhǔn)偏差SRec=1.08%，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

同時，必須對阿苯達唑的回收率進行顯著性檢驗，以確定回收率校正因子是否在計算公式中采用。顯著性檢驗采用t檢驗，當(dāng)t值大于或等于臨界值 t（95，5）=2.57 時，則 Rec 與 100%有顯著性差異，說明必須在計算公式中使用fRec修正結(jié)果；若 t值小于臨界值 t（95，5）=2.57 時，則 Rec 與100%無顯著性差異，說明不必采用fRec修正計算結(jié)果。計算結(jié)果如下：

t值遠大于臨界值 t（95，5）=2.57，說明與 100%有顯著性差異，必須在計算公式中采用修正結(jié)果。

4.5 測試過程隨機效應(yīng)導(dǎo)致的不確定度

包括樣品的均勻性和代表性、天平的重復(fù)性、體積刻度充滿的重復(fù)性、進樣的重復(fù)性和液相色譜儀積分重復(fù)性等因素引入的不確定度。通過重復(fù)測定樣品中的阿苯達唑殘留量來進行評定，結(jié)果見表4。

表4 測試過程隨機效應(yīng)導(dǎo)致的不確定度評定結(jié)果

樣品中阿苯達唑殘留量含量兩次測定的結(jié)果分別為 0.082 μg/kg、0.074 μg/kg，平均值為0.078 μg/kg。

5 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度與結(jié)果表述

6 討 論

分析結(jié)果表明，本試驗中影響測量不確定度的主要因素是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量配制過程及隨機效應(yīng)導(dǎo)致的不確定度。通過選用精密度較高的玻璃量具配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，增加樣品的測定次數(shù)，可減小引入的不確定度。

本研究建立了HPLC法分析豬肝中阿苯達唑殘留量測定結(jié)果的不確定度模型，評定了該方法的測量不確定度，為正確評價和使用檢測數(shù)據(jù)提供了依據(jù)，同時為利用高效液相色譜法測定其他獸藥殘留量的不確定度評定提供了有益的參考。

［1］中國實驗室國家認可委員會.化學(xué)分析中不確定度的評估指南［M］.北京：中國計量出版社，2002.

［2］李慎安，施昌彥，劉風(fēng).JJF1059-1999測量不確定度評定與表示［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1999.

［3］林小莉，張巍，董艷峰.高效液相色譜法測定青霉素鈉含量的測量不確定度評定［J］.中國獸藥雜志，2009，43（4）：25-28.

［4］倪育才.實用測量不確定度評定［M］.北京：中國計量出版社，2007.

Uncertainty evaluation in the determination of albendazole in liver by HPLC

TUYa*ZHANGHai-yan
（Hohhot CDC，Hohhot in inner mongolia，Hohhot 010070 ，China）

Established mathematical model of uncertainty evaluation for determining the concentration of albendazole in liver by HPLC.The sources of uncertainty were analyzed to compose steps for whole determination procedure.Analysis showed that the main factors affecting the determination of albendazole were preparation of reference materials，dilution，and randomeffects duringdetermination.

HPLC；uncertaintyevaluation；albendazole；liver

TS251.7

A

1673-6004（2011）03-0056-04

* 圖雅，女，1983年出生，2007年畢業(yè)于內(nèi)蒙古大學(xué)物理化學(xué)專業(yè)，碩士研究生，檢驗師。

2011-08-24