楊健，彭麗娟，楊曉紅

(川北醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，四川 南充 637007)

靶向線粒體綠色熒光蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及初步應(yīng)用*

楊健，彭麗娟，楊曉紅

(川北醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，四川 南充 637007)

目的:構(gòu)建靶向線粒體綠色熒光蛋白(EGFP)表達(dá)載體，觀測(cè)其在蛋白質(zhì)細(xì)胞內(nèi)定位中的應(yīng)用價(jià)值。方法:化學(xué)合成細(xì)胞色素C氧化酶8A亞單位信號(hào)肽編碼序列，克隆該序列到載體pEGFP-N1多克隆區(qū)Nhe I和Hind III位點(diǎn)得到質(zhì)粒pMito-EGFP，經(jīng)測(cè)序鑒定后，用線粒體探針mitotracker染色已轉(zhuǎn)染該載體的Hela細(xì)胞，熒光顯微鏡檢測(cè)EGFP的細(xì)胞定位。以EPEC/EspF和EPEC/EspFL16E感染經(jīng)pMito-EGFP轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)法和熒光顯微鏡法觀測(cè)野生型EspF和突變型EspFL16E的分布。結(jié)果:測(cè)序表明融合表達(dá)載體構(gòu)建成功，熒光顯微鏡及圖像分析表明該載體表達(dá)的EGFP和mitotracker共同定位于細(xì)胞線粒體;用其作為探針發(fā)現(xiàn):野生型EspF定位于細(xì)胞線粒體，而突變型EspFL16E定位于胞漿中。結(jié)論:pMito-EGFP可作為線粒體的分子探針對(duì)靶向線粒體的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位。

線粒體;分子探針;致病性大腸桿菌

致病性大腸桿菌(enteropathogenic Escherichia coli，EPEC)是發(fā)展中國(guó)家引起嬰幼兒腹瀉的一個(gè)重要的非侵入性病原體，據(jù)報(bào)道［1－2］:在嬰幼兒感染性腹瀉中，EPEC感染發(fā)病率僅次于輪狀病毒，與志賀氏菌相接近，大約占嬰幼兒感染性腹瀉的(5－10)%。EPEC感染以后主要靠III型分泌系統(tǒng)(type III secretion system，T3SS)分泌轉(zhuǎn)位效應(yīng)分子到宿主細(xì)胞引起細(xì)胞病變［3］，效應(yīng)分子轉(zhuǎn)位到宿主細(xì)胞以后具有不同的細(xì)胞定位，為了探索效應(yīng)分子的定位，以及克服線粒體化學(xué)標(biāo)志不能固定或是固定以后熒光減弱的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)計(jì)劃構(gòu)建一個(gè)表達(dá)靶向線粒體的綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒，以標(biāo)記線粒體，易于檢測(cè)線粒體病變或者對(duì)靶蛋白的線粒體定位。

1 材料方法

1.1 材料

質(zhì)粒pEGFP－N1購(gòu)自clonetech公司產(chǎn)品，電泳儀及電泳槽購(gòu)自Bio－Rad，Hela細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)(ATCC NO.CCL2)，線粒體探針mitotracker購(gòu)自molecular probe，lipofectamine 2000和Alexa(588nm)標(biāo)記的羊抗兔抗體購(gòu)自invitrogen，熒光顯微鏡購(gòu)自?shī)W林巴斯公司，抗EPEC EspF抗體由本所免疫家兔制備，DPAI購(gòu)自碧云天公司，野生型EPEC/EspF和突變型EPEC/EspFL16E由英國(guó)紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)Kenny教授惠贈(zèng)本所保存。

1.2 方法

1.2.1 靶向線粒體載體的構(gòu)建:通過Genbank查找細(xì)胞色素C氧化酶8A亞單位DNA序列，化學(xué)合成互補(bǔ)的寡核苷酸鏈，在其兩端加上Nhe I和Hind III酶切位點(diǎn)粘端，CGTCGACTGCAGAGATCCGCTAG GGGTACTCCGTG CCATCATGTCCGTCCTGACGCCGCTGCTGCTGCGGG GCTTGACAGGCTCGGCCCGGCGGCTCCC AGTGCCG CGCGCCAAGATCCATTCGTTGCCGCCGGAGGGG(下劃線處為Nhe I識(shí)別位點(diǎn))CGGCGGCAACGAATGGATCTTGGCGCGCGGCACTG GGAGCCGCCGGGCCGAGCCTGTCAAGCCCCGCAGC AGCAGCGGCGTCAGGACGGACATGATGGCACGGAG TACCCCTAGCGGATCTCTGCAGTC GACGGTACCAG ATCT(下劃線處為Hind III識(shí)別位點(diǎn))。將人工合成的Oligo1與oligo2寡核苷酸溶于滅菌雙蒸水至濃度10mM，各取10μl混合，加熱到95℃，自然冷卻退火兩序列，取3μl與經(jīng)NheⅠ和HindⅢ雙酶切的pEGFPN1于4℃連接過夜，次日轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α。

1.2.2 載體的測(cè)序鑒定:挑取卡那酶素抗性的細(xì)菌克隆3個(gè)，提取質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，將含有正確插入序列的質(zhì)粒命名為pMito-EGFP。

1.2.3 載體的表達(dá)定位鑒定:以含有100ml/L牛血清的DMEM培養(yǎng)Hela細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到90%融合度時(shí)消化細(xì)胞，按3×105個(gè)/孔接種到放有滅菌的蓋玻片的24孔板中，第次日按1.5ul lipofectamine和0.5mg質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染各孔轉(zhuǎn)染細(xì)胞，4小時(shí)后更換新鮮培養(yǎng)基，第三天，用mitotracker染色細(xì)胞30分鐘，37℃PBS洗滌細(xì)胞1次后，熒光顯微鏡鏡檢，并用圖象軟件photoshop重疊圖片。

1.2.4 用p-Mito-EGFP作為標(biāo)記蛋白，檢測(cè)EPEC EspF蛋白的定位:以Hela細(xì)胞進(jìn)行爬片，次日，用pMito－EGFP轉(zhuǎn)染爬片上的Hela細(xì)胞，第三天，用經(jīng)DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)的EPEC和EPEC/EspFl16E感染培養(yǎng)的Hela細(xì)胞，1小時(shí)后，用PBS洗去細(xì)菌，取出爬片，40g/L多聚甲醛固定30分鐘，1ml/L Tritonx-100透膜10分鐘，抗EspF染色1小時(shí)，PBS洗滌，Alexa(588nm)標(biāo)記的羊抗兔抗體和DAPI共染色40分鐘，PBS洗滌，封片，熒光顯微鏡鏡檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 融合表達(dá)質(zhì)粒的測(cè)序鑒定

測(cè)序表明(圖1)，靶向線粒體序列與Genbank(NM_004074)公布的細(xì)胞色素C氧化酶8A亞單位的序列一致，并且與EGFP的序列融合在一個(gè)完整的開放讀碼框內(nèi)，無移碼突變和點(diǎn)突變。

2.2 融合蛋白的表達(dá)定位

以質(zhì)粒pmito－EGFP轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，用mitotracker染色，活細(xì)胞顯微鏡觀察可見:mitotracker定位于線粒體，紅色，呈點(diǎn)狀或小桿狀，而轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pmito－EGFP的Hela細(xì)胞，可見在細(xì)胞的胞漿里有小點(diǎn)狀的，桿狀的或是球狀的染色，呈綠色。把兩圖片融合以后，可見兩種染色重合在一起，變成黃色，表示:融合蛋白的定位與mitotracker一致，即定位于細(xì)胞線粒體(見圖2)。

2.3 pmito-EGFP作為線粒體標(biāo)記蛋白對(duì)EPEC EspF蛋白的定位

用DAPI對(duì)細(xì)胞核染色，發(fā)現(xiàn)Hela細(xì)胞核核細(xì)菌皆被染成藍(lán)色，用抗EspF抗體檢測(cè)EspF分布，發(fā)現(xiàn)野生型EspF分布于細(xì)胞漿中，成點(diǎn)狀，而第16為氨基酸突變的EspFL16E雖然也分布于細(xì)胞漿中，但是呈均勻分布，pmito－EGFP表達(dá)的綠色熒光蛋白分布于細(xì)胞漿中，成點(diǎn)狀，融合圖片發(fā)現(xiàn):EspF可以和EGFP重合而呈現(xiàn)黃色，而EspFL16E不能與EGFP重合。表明:Mito－EGFP和EspF一樣定位于線粒體，而EspFL16E均勻分布于胞漿(見圖3)。

3 討論

線粒體是細(xì)胞內(nèi)的一種非常重要的細(xì)胞器，與細(xì)胞能量代謝，細(xì)胞周期，細(xì)胞凋亡等過程密切相關(guān)。一些病原體感染宿主細(xì)胞以后，破壞細(xì)胞線粒體的功能是其致病機(jī)制之一［4］，因此對(duì)線粒體的研究(包括線粒體蛋白定位、線粒體膜電位檢測(cè)等)是研究病原體致病機(jī)制的重要組成部分。EPEC是發(fā)展中國(guó)家嬰兒腹瀉的一個(gè)非常重要的病原體，其致病過程中，T3SS轉(zhuǎn)位效應(yīng)分子到宿主細(xì)胞，并作用于線粒體，破壞線粒體功能，引起宿主細(xì)胞病變［3］。現(xiàn)在雖然有大量的線粒體化學(xué)標(biāo)記物，但都有相應(yīng)的缺點(diǎn)存在，如:只能活細(xì)胞觀察，不能耐受多聚甲醛固定或固定后熒光大大減弱，容易在紫外光的激發(fā)下碎滅等。細(xì)胞色素C氧化酶依靠其8A亞單位編碼的引導(dǎo)肽靶向細(xì)胞線粒體［5］，因此我們把引導(dǎo)肽融合到EGFP的氨基端，期望獲得一定位于線粒體的EGFP融合蛋白，測(cè)序結(jié)果表明引導(dǎo)肽編碼序列與EGFP序列融合成為一個(gè)完整的開放讀碼框，無任何堿基突變，轉(zhuǎn)染細(xì)胞以后用熒光顯微鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)融合蛋白高表達(dá)，圖像重疊后發(fā)現(xiàn)融合蛋白與線粒體探針mitotracker表達(dá)定位一致，皆位于細(xì)胞線粒體。為進(jìn)一步驗(yàn)證該載體的作用，本實(shí)驗(yàn)用EPEC感染Hela細(xì)胞，EPEC感染以后，可以把效應(yīng)分子通過T3SS注入宿主細(xì)胞，其中一些分子定位于線粒體，如EspF，而突變的EspFL16E不能再定位線粒體［6，7］，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn):EspF成點(diǎn)狀分布于細(xì)胞漿，通過重疊圖像分析發(fā)現(xiàn):pmito－EGFP表達(dá)的綠色銀光蛋白與EspF分布不一致，而與EspFL16E分布不一致。表明pmito－EGFP可作為蛋白線粒體定位的標(biāo)記載體，可以直接用熒光顯微鏡觀察，也可以通過多聚甲醛等固定后再觀察。

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Construction and Preliminary Application on the Vector Expressing Green Fluorescence Protein Target to Mitochondria

YANG Jian，PEN Li-juan，YANG Xiao-hong
(Department of Medical Microbiology and Immunology，North Sichuan Medical College，Nanchong，Sichuan 637007)

Objective:To construct the plasmid pMito-EGFP which expressed enhancing green fluorescence protein(EGFP)target to mitochondria of mammalian cells and investigate the preliminary application.MethodsThe plasmid pMito-EGFP was constructed by cloning the synthesized DNA sequence encoded signal peptide of cytochrome c oxidase subunit 8A between the Nhe I and Hind III site of pEGFP-N1 and determined by sequencing.Hela cells were stained with mitochondrial marker mitotracker after transfection with pMito-EGFP and the location of fluorescence was detected by fluorescence microscopy.Prior to infection with EPEC/EspF and EPEC/Esp-FL16E，Hela cells were transfected with pMito-EGFP，then the wide type EspF and mutant EspFL16E were stained by immunocytochemistry and the fluorescence was checked with fluorescence microscopy.Results:The vector pMito-EGFP was constructed successfully and EGFP was detected collocation in the mitochondria with mitochondrial marker mitotracker.Further investigation found wild type EspF injected by EPEC located in the mitochondria，nevertheless mutant EspF/L16E located in the cytoplasm.ConclusionThe vector pMito-EGFP can serve as a mitochondrial molecular probe for subcellular localization of protein target mitochondria.

Mitochondria;Molecular probe;EPEC

1005-3697(2011)05-0397-04

R516.1

A

四川省科技廳項(xiàng)目(2009SZ0260);川北醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(KFJJ09－02)

楊健(1974－)，男，重慶合川人，博士，副教授，Tel:0817－2242780;E－mail:jiany74@163.com

2011－09－02

(學(xué)術(shù)編輯:敬保遷)

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