孫輝，趙新淮

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

酪蛋白類(lèi)蛋白物的溶劑分級(jí)和酶水解對(duì)ACE抑制活性的影響

孫輝，趙新淮

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

利用響應(yīng)面法優(yōu)化類(lèi)蛋白反應(yīng)條件修飾酪蛋白水解物制備酪蛋白類(lèi)蛋白物。酪蛋白類(lèi)蛋白物的ACE抑制活性高于酪蛋白水解物，IC50值從52.6 mg/L降低到14.9 mg/L。利用乙醇-水混合溶劑對(duì)酪蛋白水解物和類(lèi)蛋白物進(jìn)行分級(jí)，結(jié)果表明，極性最低的溶劑得到的上清液部分活性較高，而沉淀部分活性較低。4種蛋白酶水解酪蛋白類(lèi)蛋白物的分級(jí)產(chǎn)物，導(dǎo)致活性下降，除堿性蛋白酶外，木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解產(chǎn)物ACE抑制活性為31.5%～46.8%，但是仍然高于酪蛋白水解物的ACE抑制活性（27.8%），表明類(lèi)蛋白反應(yīng)提高了酪蛋白水解物對(duì)一些蛋白酶的體外抵抗能力。

酪蛋白水解物；類(lèi)蛋白反應(yīng)；堿性蛋白酶；乙醇分級(jí)；ACE抑制活性

0 引 言

Oshima等[1]從蛋白凝膠水解物中分離出6個(gè)ACE抑制肽之后，大量的ACE抑制肽從不同食品蛋白質(zhì)的酶解產(chǎn)物中分離，包括：大豆蛋白、玉米蛋白、菜籽蛋白、乳蛋白、魚(yú)肉蛋白、米糟和酒糟蛋白、雞蛋蛋白、蝦蛋白以及其他蛋白質(zhì)[2-12]。

類(lèi)蛋白反應(yīng)在化學(xué)機(jī)制上涉及肽分子的縮合作用[13]、轉(zhuǎn)肽作用[14]。利用類(lèi)蛋白反應(yīng)修飾活性肽，將導(dǎo)致某些肽分子的結(jié)構(gòu)改變（即產(chǎn)生新的序列）和活性變化。堿性蛋白酶催化下，酪蛋白水解物的類(lèi)蛋白反應(yīng)修飾可以提高其體外ACE抑制活性[15-16]。因此，本研究在此基礎(chǔ)上，利用乙醇-水溶劑體系處理修飾產(chǎn)物，得到2個(gè)分級(jí)產(chǎn)物（上清液部分和沉淀部分），然后研究分級(jí)產(chǎn)物的ACE抑制活性以及體外酶水解對(duì)活性的影響作用。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料

酪蛋白（蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)86.1%），堿性蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，兔肺丙酮粉和FAPGG（FA-Phe-Gly-Gly），其他所有試劑均為分析純。

1.2 設(shè)備

UV-2401PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，AL204型分析天平，LGJ-1型真空冷凍干燥機(jī)，HZQ-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱，DELTA 320型精密pH計(jì)，G1-21M離心機(jī)，H-1型微型漩渦混合器，YH-4BS型遠(yuǎn)紅外恒溫干燥箱，DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白水解物的制備

配制質(zhì)量濃度為100 g/L的酪蛋白溶液，用濃度為2 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0，加入堿性蛋白酶（1 kU/g），55℃下分別水解1，2，3，4，5，6，7，8 h；取出20 mL樣品溶液，迅速置沸水浴中滅酶，冷卻后2 800 g離心20 min，分離出上清液，測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)和游離氨基量，計(jì)算其水解度；同時(shí)測(cè)定上清液的ACE抑制活性和IC50。根據(jù)ACE抑制活性大小確定酪蛋白水解物的制備條件，放大試驗(yàn)，制備的上清液（酪蛋白水解物）真空冷凍干燥后于-20℃保藏。

1.3.2 酪蛋白水解物的類(lèi)蛋白反應(yīng)修飾

用堿性蛋白酶對(duì)酪蛋白水解產(chǎn)物進(jìn)行類(lèi)蛋白反應(yīng)修飾。反應(yīng)結(jié)束后，修飾產(chǎn)物（類(lèi)蛋白物）在沸水浴滅酶15 min，冷卻后測(cè)定游離氨基量。

采用中心組合實(shí)驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系的游離氨基量減少量變化（底物游離氨基含量減去修飾產(chǎn)物游離氨基量），響應(yīng)面法優(yōu)化酶添加量、底物濃度、溫度等3個(gè)反應(yīng)條件，然后分析類(lèi)蛋白物的ACE抑制活性和IC50。

1.3.3 乙醇-水溶劑的分級(jí)處理

將具有最高ACE抑制活性的酪蛋白水解物和類(lèi)蛋白物，分別加入到3個(gè)乙醇-水混合溶劑（體積比分別為3∶7，5∶5，7∶3）中，使其質(zhì)量濃度達(dá)到500 g/L。 混勻后于9 000 g條件下離心30 min，分離出上清液和沉淀部分（分級(jí)產(chǎn)物），并分別測(cè)定肽收率、游離氨基量和ACE抑制活性。根據(jù)ACE抑制活性大小，確定溶劑的組成，放大試驗(yàn)，將上清液和沉淀部分分別凍干。

1.3.4 分級(jí)產(chǎn)物的進(jìn)一步酶水解

配置質(zhì)量濃度為100 g/L的分級(jí)產(chǎn)物水溶液，分別加入蛋白酶進(jìn)行水解，所選擇的條件為：堿性蛋白酶，pH值為8.0，溫度55℃，酶添加量1 000 U/g；胰蛋白酶，pH值為8.1，溫度37℃，酶添加量2 000 U/g；中性蛋白酶，pH值為7.0，溫度40℃，酶添加量1 000 U/g；木瓜蛋白酶，pH值為6.5，溫度45℃，酶添加量2 000 U/g。在反應(yīng)進(jìn)行10 min和30 min時(shí)，迅速加熱至95℃滅酶終止反應(yīng)，得到的酶解產(chǎn)物進(jìn)行相關(guān)分析。

1.3.5 有關(guān)分析和測(cè)定

1.3.5.1 蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、水解度及蛋白酶活力的測(cè)定

（1）蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定采用凱氏定氮法[17]。

（2）游離氨基量及酪蛋白水解度（DH）測(cè)定采用鄰苯二甲醛（OPA）法[18-19]。

OPA試劑：稱取2.00 g十二烷基磺酸鈉（SDS），加入30 mL濃度為0.4 mol/L的硼酸緩沖溶液 （pH 9.5），水浴加熱使其完全溶解，冷卻至室溫后再加入1 mL質(zhì)量濃度為80 g/L的OPA乙醇溶液和200 μL β-巰基乙醇，硼酸緩沖溶液定容至100 mL，此溶液要現(xiàn)用現(xiàn)配。

游離氨基量測(cè)定：配制不同濃度的亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0～30 mg/L），取3 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液與同體積的OPA試劑混合并開(kāi)始計(jì)時(shí)，5 min后在分光光度計(jì)上340 nm波長(zhǎng)下測(cè)定。以吸光值為橫坐標(biāo)、亮氨酸質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟，測(cè)定樣品的吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算其游離氨基量。

水解度計(jì)算公式[20]如下：

其中0.6 mmol/g為實(shí)際測(cè)定出的酪蛋白的游離氨基量。

（3）蛋白酶活力測(cè)定：采用福林酚法、以酪蛋白為底物測(cè)定[21]。

1.3.5.2 ACE抑制活性的測(cè)定

以FAPGG為底物，采用非連續(xù)分光光度法測(cè)定樣品的ACE抑制活性[22-23]。

ACE酶液：稱取50 mg兔肺丙酮粉浸泡于5 mL預(yù)冷至4℃的硼酸緩沖溶液（pH值為8.3，濃度100 mmol/L）中，放入4℃恒溫震蕩搖床中提取12 h，45 000 g冷凍離心20 min，上清液于4℃低溫保存。

FAPGG底物溶液：將FAPGG溶于濃度為100mmol/L的硼酸緩沖溶液 （pH值為8.3，濃度為300 mmol/L的NaCl），配制濃度為1.6 mmol/L的溶液。

ACE抑制活性測(cè)定：500 μL FAPGG底物溶液與100 μL超純水或ACE抑制肽溶液混勻，37℃預(yù)熱2 min，加300 μL ACE酶液并在37℃反應(yīng)30 min，立即加100 μL EDTA（濃度為100 mmol/L）終止反應(yīng)；加3 000 μL超純水稀釋，平行3次。0 min樣品的測(cè)定時(shí)先加入EDTA再加入ACE酶液，其他相同。分光光度計(jì)上340 nm下分別測(cè)體系在0 min和30 min時(shí)的吸光值，計(jì)算差值△A（△A=A0min–A30min）。以單位時(shí)間內(nèi)吸光值變化表示ACE酶活力，對(duì)ACE的抑制活性按下式計(jì)算：

式中：△Ac，加入超純水時(shí)吸光值在30 min內(nèi)的變化；△Ai，為加入抑制劑時(shí)吸光值在30 min內(nèi)的變化。

IC50計(jì)算：IC50定義為抑制50%ACE酶活力時(shí)抑制劑的濃度；配置不同濃度或質(zhì)量濃度的ACE抑制劑，按以上步驟測(cè)定其ACE抑制活性。以抑制劑質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)、ACE抑制活性為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，利用回歸方程計(jì)算抑制劑的半抑制濃度（IC50）。

2 結(jié)果與討論

2.1 酪蛋白水解物的制備

蛋白質(zhì)本身的ACE抑制活性很低，甚至不具有活性，但通過(guò)體內(nèi)或體外蛋白酶水解，釋放出來(lái)的肽即可在體內(nèi)外發(fā)揮ACE抑制活性。堿性蛋白酶屬于內(nèi)切酶， 對(duì)由Phe，Trp，Tyr，Glu，Met，Leu，Ala，Ser和Lys形成的肽鍵具有高度專一性[24]。選用堿性蛋白酶水解酪蛋白，可以獲得較高活性的ACE抑制肽。試驗(yàn)結(jié)果表明，在所選擇的條件下利用堿性蛋白酶水解酪蛋白時(shí)，酪蛋白水解物的ACE抑制活性先隨水解時(shí)間增加而增加，后呈現(xiàn)降趨勢(shì)；在水解時(shí)間為6 h時(shí)，酪蛋白水解物的ACE抑制活性最高 （27.8%），此時(shí)水解度為10.9%， 其 游 離 氨 基 量 為1 780.9 μmol/g，IC50為52.6 mg/L。所以，選擇此酪蛋白水解物作為類(lèi)蛋白修飾反應(yīng)的底物。

2.2 酪蛋白水解物的類(lèi)蛋白反應(yīng)修飾與產(chǎn)物ACE抑制活性

固定反應(yīng)時(shí)間為6 h，采用三因素五水平響應(yīng)面方法（共20組實(shí)驗(yàn)，表1）分析，以反應(yīng)體系游離氨基減少量為響應(yīng)值，研究酶添加量、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度對(duì)酪蛋白類(lèi)蛋白反應(yīng)修飾的影響。表1響應(yīng)面分析的因素水平編碼

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果（這里不再介紹），得到優(yōu)化的修飾反應(yīng)條件為：酶添加量3.1 kU/g，溫度25℃，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%，反應(yīng)時(shí)間6 h。最大響應(yīng)值游離氨基量減少為116.97 μmol/g。驗(yàn)證試驗(yàn)3次，得到的游離氨基量減少為112.09 μmol/g（平行值），與理論值無(wú)顯著差異，說(shuō)明響應(yīng)面法得到的條件參數(shù)可靠。酪蛋白水解產(chǎn)物修飾后，所得到的酪蛋白類(lèi)蛋白物具有更高的ACE抑制活性（73.2%），分析結(jié)果表明其IC50降低至14.9 mg/L（低于酪蛋白水解物的52.6 mg/L）。所以，選擇此類(lèi)蛋白物作為溶劑分級(jí)的底物。

2.3 乙醇-水溶劑分級(jí)處理與分級(jí)產(chǎn)物的ACE抑制活性

用3個(gè)乙醇-水混合溶劑 （乙醇和水體積比分別為3∶7，5∶5，7∶3）對(duì)酪蛋白水解物進(jìn)行分級(jí)，得到相應(yīng)的上清液部分和沉淀部分。分析結(jié)果表明這兩部分組成、ACE抑制活性存在不同，與所使用的分級(jí)溶劑的組成有關(guān)，如表2所示。上清液部分的回收率隨分級(jí)溶劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而減少，而沉淀部分則相反；由于有少量損失，二者之和不足100%。重要的是，上清液部分的ACE抑制活性均高于酪蛋白水解物，而沉淀部分活性均低于酪蛋白水解物，且用7∶3（體積比）乙醇-水溶劑分級(jí)處理時(shí)所得到的上清液部分活性最高（34.0%）。這表明：低極性的乙醇-水溶劑體系可以用于分離出更高ACE抑制活性的蛋白質(zhì)水解物。

同樣，用這3個(gè)乙醇-水溶劑對(duì)酪蛋白類(lèi)蛋白物進(jìn)行分級(jí)處理，結(jié)果如表3所示。分析結(jié)果顯示，上清液、沉淀部分的回收率、游離氨基量、ACE抑制活性變化，與酪蛋白水解物的分級(jí)產(chǎn)物的變化規(guī)律基本一致。用7∶3（體積比）乙醇-水溶劑分級(jí)時(shí)，得到的上清液部分活性最高（78.8%），IC50降低至11.8 mg/L。

表2 酪蛋白水解物的乙醇-水溶劑分級(jí)與分級(jí)產(chǎn)物的ACE抑制活性

表3 酪蛋白類(lèi)蛋白物的乙醇-水溶劑分級(jí)與分級(jí)產(chǎn)物的ACE抑制活性

Pan等研究指出，ACE抑制肽富含疏水性氨基酸和芳香族氨基酸[25]。乙醇極性低，水的極性較高。所選擇的3個(gè)溶劑中，7∶3（體積比）的乙醇-水溶劑具有最高的乙醇體積分?jǐn)?shù)和最低的極性。所以，這個(gè)溶劑可以富集低極性（含較多的疏水性氨基酸）的肽組分，而沉淀則富集高極性（含較多親水性氨基酸）的肽組分。這樣就導(dǎo)致上清液部分具有較高的ACE抑制活性，而沉淀部分的ACE抑制活性相應(yīng)降低。

2.4 分級(jí)產(chǎn)物進(jìn)一步酶解與ACE抑制活性變化

對(duì)酪蛋白類(lèi)蛋白物的乙醇-水溶劑（7∶3，體積比）分級(jí)產(chǎn)物進(jìn)一步酶水解，分別測(cè)定水解產(chǎn)物的的游離氨基增加量和ACE抑制活性，表4給出分析結(jié)果?？梢钥闯觯海?）堿性蛋白酶對(duì)分級(jí)產(chǎn)物有較強(qiáng)的水解作用（游離氨基增加量較大），胰蛋白酶則剛好相反；（2）所有的水解產(chǎn)物的ACE抑制活性從19.2%到46.8%，均低于酪蛋白類(lèi)蛋白物（73.2%）和分級(jí)產(chǎn)物（上清液部分78.8%，沉淀部分65.6%），表明分級(jí)產(chǎn)物的進(jìn)一步水解會(huì)破壞類(lèi)蛋白物的ACE抑制活性，且降低程度與水解酶（例如堿性蛋白酶）和水解時(shí)間（例如30 min）密切相關(guān)；（3）整體上看，堿性蛋白酶對(duì)分級(jí)產(chǎn)物的ACE抑制活性破壞最大，其他3種蛋白酶的破壞作用相對(duì)較小；（4）即使水解30 min，其他3種蛋白酶水解產(chǎn)物的ACE抑制活性為31.5%到46.8%，高于酪蛋白水解物的活性（27.8%）。通過(guò)以上分析可以看出，類(lèi)蛋白反應(yīng)能夠提高酪蛋白水解物的ACE抑制活性，同時(shí)還使得它（或者說(shuō)分級(jí)產(chǎn)物）對(duì)一些蛋白酶具有一定的抵抗能力，即提高了其穩(wěn)定性。

表4 酶水解對(duì)酪蛋白類(lèi)蛋白物分級(jí)產(chǎn)物ACE抑制活性的影響

3 結(jié) 論

（1）利用堿性蛋白酶對(duì)酪蛋白進(jìn)行水解和分離，在水解時(shí)間為6 h時(shí)制備出水解度為10.9%的酪蛋白水解物，其ACE抑制活性最高27.8%，IC50質(zhì)量濃度為52.6 mg/L，游離氨基量為1780.9 μmol/g。

（2）利用堿性蛋白酶對(duì)酪蛋白水解物進(jìn)行修飾時(shí)，以游離氨基含量減少量為指標(biāo)，響應(yīng)面法優(yōu)化得到的反應(yīng)條件為：酶添加量3.1 kU/g，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%，反應(yīng)溫度25℃，反應(yīng)時(shí)間6 h。制備的酪蛋白類(lèi)蛋白物游離氨基量為1668.8 μmol/g，IC50降低至14.9 mg/L。

（3）對(duì)酪蛋白水解物進(jìn)行乙醇-水溶劑分級(jí)處理。結(jié)果表明，7∶3（體積比）乙醇-水分級(jí)得到的上清液部分ACE抑制活性明顯高于酪蛋白水解物，沉淀部分的ACE抑制活性則低于酪蛋白水解物。對(duì)酪蛋白類(lèi)蛋白物同樣進(jìn)行乙醇-水溶劑分級(jí)處理，產(chǎn)生相似的結(jié)果。低極性溶劑富集疏水性肽組分，是分級(jí)產(chǎn)物上清液部分ACE抑制活性顯著提高的主要原因。

（4）酪蛋白類(lèi)蛋白物分級(jí)產(chǎn)物的進(jìn)一步酶水解，會(huì)降低其ACE抑制活性。分級(jí)產(chǎn)物對(duì)堿性蛋白酶的抗拒能力較弱，對(duì)胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶的抗拒能力相對(duì)較強(qiáng)。水解后的分級(jí)產(chǎn)物其ACE抑制活性大多高于酪蛋白水解物，表明類(lèi)蛋白反應(yīng)提高了酪蛋白ACE抑制肽的活性與穩(wěn)定性。

[1]OSHIMA G,NAGASAWA K.Stereospecificity of Peptidyl Dipeptide Hydrolase：Angiotensin I-converting Enzyme[J].Journal of Biochemistry,1979,86（6）：1719-1724.

[2]KUBA M,TANA C,TAWATA S,et al.Production of Angiotensin I-converting Enzyme Inhibitory Peptides from Soybean Protein with Monascus Purpureus Acid Proteinase[J].Process Biochemistry,2005,40（6）：2191-2196.

[3]PARRIS N,MOREAU R A,JOHNSTON D B,et al.Angiotensin I-converting Enzyme-inhibitory Peptides from Commercial Wet-and dry-milled Corn Germ[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2008,56（8）：2620-2623.

[4]WU J P,ALUKO R E,MUIR A D.Purification of Angiotensin I-converting Enzyme Inhibitory Peptides from the Enzymatic Hydrolysate of Defatted Canola Meal[J].Food Chemistry,2008,111（4）：942-950.

[5]MIGUEL M,CONTRERAS M M,RECIO I,et al.ACE-inhibitory and Antihypertensive Properties of a Bovine Casein Hydrolysate[J].Food Chemistry,2009,112（1）：211-214.

[6]ALI B,NAIMA N A,ROZENN R P,et al.Angiotensin I-converting Enzyme（ACE）Inhibitory Activities of Sardinelle（Sardinella Aurita）by-products Protein Hydrolysates Obtained by Treatment with Microbial and Visceral Fish Serine Proteases[J].Food Chemistry,2008,111（2）：350-356.

[7]SAITO Y,WANEZAKI K,KAWATO A,et al.Structure and Activity of Angiotensin I-converting Enzyme Inhibitory Peptides from Sake and Sake Lees[J].Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,1994,58（10）：1767-1771.

[8]KAUSTAV M,WU J.Angiotensin I-converting Enzyme Inhibitory Peptides from Simulated in Vitro Gastrointestinal Digestion of Cooked Eggs[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2009,57（2）：471-477.

[9]CAO W,ZHANG C,HONG P,et al.Purification and Identification of an ACE Inhibitory Peptide from the Peptic Hydrolysate of Acetes chinensis and its Antihypertensive Effects in Spontaneously Hypertensive Rats[J].International Journal of Food Science and Technology,2010,45（5）：959-965.

[10]TSAI J S,CHEN J L,PAN B S.ACE-inhibitory Peptides Identified from the Muscle Protein Hydrolysate of Hard Clam：Meretrix Lusoria[J].Process Biochemistry,2008,43（7）：743-747.

[11]WANG J,HU J,CUI J,et al.Purification and Identification of a ACE Inhibitory Peptide from Oyster Proteins Hydrolysate and Antihypertensive Effect of Hy drolysate in Spontaneously Hypertensive Rats[J].Food Chemistry,2008,111（2）：302-308.

[12]SATO M，HOSKAIVA T,YAMAGUCHI T,et al.Angiotensin I-converting Enzyme Inhibitory Peptides Derived from Wakame（Undaria Pinnatifida）and Their Antibypertensive Effect in Spontaneously Hypertensive Rats[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2002,50（21）：6245-6252.

[13]LOZANO P,COMBES D.α-Chymotrypsin in Plastein Synthesis：InfluenceofSubstrateConcentrationonEnzymeActivity[J].Biotechnology and Applied Biochemistry,1991,14（2）：212-221.

[14]FUJIMAKI M,ARAI S,YAMASHITA M.Enzymatic Protein Degradation and Resynthesis for Protein Improvement[J].Advances in Chemistry,1977,160（6）：156–184.

[15]李亞云,趙新淮.酪蛋白水解物的酶法修飾與ACE抑制活性變化[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2009,35（5）：35-39.

[16]ZHAO X H,LI Y Y.An Approach to Improve ACE Inhibitory Ac-tivity of Casein Hydrolysates with Plastein Reaction Catalyzed by Alcalase[J].European Food Research and Technology,2009,229（5）：795-805.

[17]GB/T 5009.5-2003,食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,1992.

[18]MAHMOUD M,MALONE W,CORDLE C.Enzymatic Hydrolysis of Casein：Effect of Degree of Hydrolysis on Antigenicity and Physical Properties[J].Journal of Food Science,1992,57（5）：1223-1229.

[19]SPELLMAN D,MCEVOY E,O’CUINN G,et al.Proteinase and Exopeptidase Hydrolysis of Whey Protein：Comparison of the TNBS,OPA and pH Stat Methods for Quantification of Degree of Hydrolysis[J].International Dairy Journal,2003,13（6）：447-453.

[20]趙新淮,馮志彪.蛋白質(zhì)水解物水解度的測(cè)定[J].食品科學(xué),1994,15（11）：65-67.

[21]SB/T 10317-1999,蛋白酶活力測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,1988.

[22]CUSHMAN D,CHEUNG H.Spectrometric Assay and Properties of Angiotensin-converting Enzyme of Rabbit Lung[J].Biochemical Pharmacology,1971,20（7）：1637–1648.

[23]MURRAY B A,WALSH D J,FITZ GERALD R J.Modification of the Furanacryloyl-L-phenylalanyl-glycylglycine Assay for Determination of Angiotensin-I-converting Enzyme Inhibitory Activity[J].Journal of Biochemical and Biophysical Methods,2004,59（2）：127-137.

[24]MURUYAMA S,MITACHI H,TANAKA H,et al.Studies on the Active Site and Antihypertensive Activity of Angiotensin-I-converting Enzyme Inhibitors Derived from Casein[J].Agricultural and Biological Chemistry,1987,51（6）：1581-1586.

[25]PAN D,LUO Y,TANOKURA M.Antihypertensive Peptides from Skimmed Milk Hydrolysate Digested by Cell-free Extract of Lactobacillus helveticus JCM1004[J].Food Chemistry,2005，91（1）,123-129.

Impact of solvent fractionation and enzymatic hydrolysis of casein hydrolysate modified by plastein reaction on its ACE inhibition

SUN Hui,ZHAO Xin-huai
（Northeast Agricultural University Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Harbin 150030,China）

The prepared hydrolysate was modified by the plastein reaction under the response-surface-methodology optimized conditions to prepare casein plasteins.The casein plasteins exhibited a higher ACE-inhibitory activity in vitro than the original hydrolysate as its value of IC50 was decreased from original 52.6 to 14.9 μg/mL.When the original hydrolysate or the plasteins was fractionated by ethanol-water solvents respectively,the soluble fractions obtained by the solvent of the lowest polarity had a higher activity but the precipitate fractions a lower one.Further enzymatic hydrolysis of the fractionated products of the plasteins by four proteases would damage their activities.The analysis results showed that the final hydrolyzed products of the plasteins by papain,pepsin or trypsin except for alcalase had a residue activity about 31.5%～46.8%,higher than the original hydrolysate（27.8%）.It was revealed that the carried out plastein reaction enhanced the resistance of casein hydrolysate to some proteases in vitro.

casein hydrolysate;plastein reaction;alcalase;ethanol fractionation;ACE-inhibitory activity

Q591.2

A

1001-2230（2011）12-0004-04

2011-09-26

黑龍江省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目（2010td11）。

孫輝（1986-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。

趙新淮