陳琦，馬燕芬，王利

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)研究中心，呼和浩特 010059；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動物營養(yǎng)所，呼和浩特 010030）

乳酸菌基因組學(xué)與干酪風(fēng)味的關(guān)系

陳琦1，馬燕芬2，王利1

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)研究中心，呼和浩特 010059；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動物營養(yǎng)所，呼和浩特 010030）

介紹了乳酸菌的基因組學(xué)、乳酸菌與干酪風(fēng)味之間的關(guān)系以及干酪的成熟機(jī)制。乳酸菌基因組學(xué)研究有助于揭示乳酸菌的遺傳和代謝機(jī)制，挖掘重要益生功能基因，為乳酸菌的在干酪生產(chǎn)中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

乳酸菌；基因組學(xué)；干酪；風(fēng)味

0 引 言

乳酸菌（Lactic Acid Bacteria，LAB）是一類能夠通過同型發(fā)酵或異型發(fā)酵而產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌[1]。根據(jù)發(fā)酵形式不同，乳酸菌可以分為兩類：同型發(fā)酵菌主要產(chǎn)物為乳酸，而異型發(fā)酵菌除乳酸還同時產(chǎn)生乙酸、乙醇、二氧化碳及甲酸等[2]。乳酸菌具有加速食品酸化、產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)、增加食物營養(yǎng)并改善食品質(zhì)地等功能。實(shí)驗(yàn)證明，使用特色的發(fā)酵劑，更有利于大量生產(chǎn)均質(zhì)、高質(zhì)量的干酪。干酪工業(yè)的發(fā)展前景和經(jīng)濟(jì)活力依賴于一些已知、可以預(yù)測并具有特色的發(fā)酵劑，因此為了挖掘乳酸菌的潛力，研究者致力于乳酸菌基因組學(xué)研究，期待從分子水平揭示乳酸菌的多樣性，闡明乳酸菌的生理及代謝機(jī)制，挖掘控制重要性狀的功能基因，提高發(fā)酵食品的工業(yè)化控制水平，為高效利用乳酸菌提供依據(jù)[3]。

1 乳酸菌的基因組學(xué)

1.1 與干酪相關(guān)的基本特征

根據(jù)伯杰細(xì)菌鑒定手冊，乳酸菌目前主要分為23個屬，主要有乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lacto-coccus）、明串珠菌屬/白聯(lián)球菌屬（Leuconoszo）、片球菌屬（Pediococcus）、鏈球菌屬（Streptoeoccus）、腸球菌屬（Enleroccu）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和肉食菌屬（Caroobaelerium）等[4]。LAB新陳代謝的主要終產(chǎn)物是乳酸，其中乳桿菌、乳球菌、名串珠菌和鏈球菌是重要的工業(yè)菌。

乳酸菌廣泛分布于自然界中，主要特性為低鳥嘌呤+胞嘧啶（G+C）含量（＜55%）、強(qiáng)耐酸性、不產(chǎn)生孢子、營養(yǎng)要求高、耐氧但不需氧、不能合成卟啉。乳酸菌基因組的大小在1.8～3.2 Mb之間，基因數(shù)量和可以預(yù)測的蛋白質(zhì)數(shù)量相差較大，干酪乳桿菌ATCC334的基因組相對比較大，為3.35 Mb，以上這些差異表明乳酸菌正處于一個動態(tài)的進(jìn)化過程中[5]。大多數(shù)乳酸菌基因組G+C含量都在50%以下，唾液乳桿菌UCC118的G+C含量最低，只有33%，而雙歧桿菌的G+C含量高達(dá)60.1%。盡管LAB各個菌屬RNA結(jié)構(gòu)基因數(shù)量各異，但都含有rRNA操縱子和tRNA編碼基因，某些LAB還含有質(zhì)粒與噬菌體編碼基因，其中rRNA操縱子和tRNA編碼基因?qū)儆诨竟δ芑颍|(zhì)粒與噬菌體編碼基因?qū)儆谔厥夤δ芑颉?/p>

LAB各個菌屬的rRNA操縱子數(shù)量變化較大，其中乳桿菌屬的rRNA操縱子數(shù)量較多。rRNA操縱子排列具有一定順序性，通常為16s rRNA，23s rRNA，5s rRNA，而且在它們周圍常常會出現(xiàn)tRNA Ile，tRNAAla，tRNALys等編碼基因。tRNA編碼基因數(shù)量為43～98個，同樣乳桿菌屬偏多。

有些乳酸菌，特別是乳球菌，菌體細(xì)胞內(nèi)含有多種質(zhì)粒，大小從1.9～242 kb不等[6]。許多與工業(yè)化生產(chǎn)相關(guān)的性狀都是由這些質(zhì)粒編碼的，如乳糖代謝酶類、攝取檸檬酸鹽的酶、蛋白水解酶類、細(xì)菌素的生成、噬菌體抗性、多糖的合成等[7]。明串珠菌ATCC8293和部分乳桿菌細(xì)胞中含有質(zhì)粒，德式乳桿菌和大多數(shù)嗜熱鏈球菌細(xì)胞中則沒有質(zhì)粒，乳酸乳球菌SK11細(xì)胞中包括5個不同種類的質(zhì)粒。此外，還有一些乳酸菌具有復(fù)雜的插入重復(fù)序列（IS），說明這些LAB有較高的遺傳可塑性[8]。某些LAB中還含有噬菌體編碼基因，但數(shù)量通常都很少，僅僅為1-2個。乳酸乳球菌乳脂亞種MG 1363中的噬菌體編碼基因都攜帶有tRNA編碼基因，還含有一個噬菌體矯正序列，其中包括一個長度為712個氨基的插入序列。

1.2 與干酪相關(guān)的研究進(jìn)展

早期對乳酸菌的研究工作大多集中于菌種的分類和菌株的篩選以及構(gòu)建動物模型對部分益生特性進(jìn)行驗(yàn)證等方面的研究。隨著分子生物學(xué)理論及生物技術(shù)的發(fā)展，人們開始利用分子生物學(xué)方法對乳酸菌的分類、基因功能及其代謝途徑進(jìn)行研究。LAB中與細(xì)胞分解代謝及合成活動相關(guān)的所有管家基因都定位在染色體上，因此了解LAB染色體結(jié)構(gòu)和組成對于了解細(xì)胞分解代謝和合成具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)特定基因的微小變化或突變都會導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生變化，進(jìn)而使奶酪的品質(zhì)發(fā)生極大的變化。

自Sorokin等（2001）完成第一株乳酸菌——乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis ssp.lactis）IL1403的全基因組測序以來，掀起了乳酸菌全基因組測序的浪潮。美國成立了乳酸菌基因組協(xié)會 （LAB Genomics Consortium，LABGC），對多種乳酸菌進(jìn)行全基因組測序。迄今為止，已經(jīng)發(fā)表的乳酸菌基因組達(dá)22株，絕大多數(shù)是由美國和歐洲等發(fā)達(dá)國家的實(shí)驗(yàn)室完成的。表1列出了已完整公布全基因組序列的乳酸菌和幾個工業(yè)上比較重要的LAB菌種的基因組序列信息，14個菌種的基因組信息是公開的，其中10個是由美國的乳酸菌基因組聯(lián)盟（LABGC）研究的結(jié)果。

對乳酸菌基因組學(xué)的深入研究有利于其在乳品發(fā)酵方面應(yīng)用，例如：篩選具有特定胞外多糖特性及數(shù)量的嗜熱鏈球菌；分析乳酸菌的基因組可以將其的基因特點(diǎn)和益生功能聯(lián)系起來在分子水平上篩選具有特定功效的菌株；進(jìn)一步探索噬菌體的分子進(jìn)化規(guī)律，闡明乳酸菌噬菌體的機(jī)制。

嗜酸乳桿菌NCFM是全球第一個完成基因序列的商業(yè)菌株。通過對該菌株的全基因序列分析，可以將其基因序列的某些片段與菌株的生物化學(xué)，生理特性及功能，加工與儲存特性（如菌株的發(fā)酵條件，儲存過程的穩(wěn)定性，凍干條件）相聯(lián)系。

表1 與乳制品有關(guān)的乳酸菌和其他菌種的基因組序列

嗜熱鏈球菌是工業(yè)化應(yīng)用中最重要的乳酸菌之一，廣泛地用于多種奶酪和酸奶的生產(chǎn)，近年來對嗜熱鏈球菌噬菌體的廣泛和深入研究也成為熱點(diǎn)。目前，已經(jīng)公開發(fā)表的嗜熱鏈球菌噬菌體的完整基因序列有7種，包括cos-類噬菌體DT1,Sfi19,Sfi21,7201及pac-類噬菌體O1205,Sfi11和2972。

鼠李糖乳桿菌Howaru Rhamnosus也是目前研究較多的、保健功效較強(qiáng)的益生菌。研究證明其具有調(diào)整腸道菌群，抑制腸道有害菌，激活免疫功能等功效。測序研究發(fā)現(xiàn)其已知基因900多個，其中300多個和益生菌功能有關(guān)。該菌株能夠合成除色氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、頡氨酸之外的全部氨基酸，還可以合成葉酸、亞鐵原卟啉、維生素B1等生長因子。

2 乳酸菌基因組學(xué)與干酪風(fēng)味

干酪風(fēng)味是由干酪中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和芳香性風(fēng)味物質(zhì)組成的混合物，主要包括原料乳中的風(fēng)味化合物及成熟過程中酶和微生物作用于基質(zhì)產(chǎn)生的風(fēng)味化合物。具有風(fēng)味活性的物質(zhì)多數(shù)是有機(jī)物，包括酸、醇、酯、內(nèi)酯、酮、酚、醛、醚等。

雖然早在100年前就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)LAB和干酪風(fēng)味之間的關(guān)系，但由于微生物學(xué)、酶學(xué)和干酪微環(huán)境的復(fù)雜性，早期很難定義LAB是如何影響干酪風(fēng)味的。直到20世紀(jì)50年代后期，英國食品研究學(xué)院的Elisabeth Sharpe等發(fā)明了無菌加工干酪技術(shù)，進(jìn)而證明LAB是產(chǎn)生干酪風(fēng)味所必需的。

許多微生物對干酪風(fēng)味的形成是至關(guān)重要的。干酪微生物主要分為兩大類：發(fā)酵微生物和次級微生物。發(fā)酵微生物在干酪的制作過程中主要起著產(chǎn)酸和促進(jìn)凝乳的作用。主要的發(fā)酵微生物是乳酸菌（LAB），不同種類的LAB也可能影響干酪風(fēng)味，這個領(lǐng)域的研究主要集中在乳酸球菌屬，它是切達(dá)干酪，高達(dá)干酪及許多其它干酪和與牛奶有關(guān)的乳酸菌品種的發(fā)酵劑。由于工業(yè)化方面的應(yīng)用，已經(jīng)對乳酸乳球菌代謝機(jī)制、遺傳、分子生物學(xué)和生理方面進(jìn)行了廣泛深入的研究，并已成為乳酸菌研究的模式菌[4]。乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）主要用作干酪的發(fā)酵劑，分為乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactis ssp.cremoris）和乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis ssp.lactis），前者適用制作硬質(zhì)奶酪，后者適用制作軟質(zhì)奶酪。次級微生物在干酪的制作過程中不能產(chǎn)酸，但在成熟過程中對風(fēng)味形成有著很重要的作用。非發(fā)酵劑乳酸菌（NSLAB）是其中主要的次生菌群。

干酪在成熟開始時，發(fā)酵劑的數(shù)目通常每克干酪超過109CFU（見圖1），但是干酪成熟對微環(huán)境的要求很嚴(yán)格，比如殘留乳糖、高濃度的NaCl，低pH值和低溫都會影響發(fā)酵劑的成活率，大部分發(fā)酵劑自我分解，導(dǎo)致成熟細(xì)胞內(nèi)的酶和其他細(xì)胞組分釋放到干酪組中，進(jìn)而影響成熟過程。起初NSLAB菌群的數(shù)目一般在102CFU/g以下，然后開始生長，在成熟的3～9個月后細(xì)胞密度最終穩(wěn)定在107CFU/g～109CFU/g（見圖1）。

3 干酪成熟機(jī)制

干酪成熟過程主要包括乳糖代謝、蛋白質(zhì)水解和脂肪分解三大生化反應(yīng)。在發(fā)酵劑的作用下，乳糖經(jīng)糖酵解途徑或異戊二糖途徑產(chǎn)生乳酸；蛋白質(zhì)在干酪中殘留的凝乳酶、乳內(nèi)源性酶和微生物酶的作用下水解成肽和氨基酸；脂肪在脂肪酶作用下水解成脂肪酸、醇類、醛類等一系列化合物。

乳糖酵解后產(chǎn)生乳酸，產(chǎn)生乳酸的多少直接影響干酪的質(zhì)量，因?yàn)樵谂囵B(yǎng)過程中，乳酸決定最終的pH值及凝乳中的礦物質(zhì)含量，同時影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和凝乳中殘留的促凝劑的數(shù)量，進(jìn)而最終影響干酪的質(zhì)地和風(fēng)味。乳酸鹽本身也是形成干酪風(fēng)味的成分，并將其轉(zhuǎn)化為丙酸和二氧化碳；丙酸也是形成干酪風(fēng)味的重要成分，而二氧化碳則可以使干酪出現(xiàn)蜂窩眼。若發(fā)酵劑迅速耗盡凝乳中殘留的糖，這樣就可以避免產(chǎn)生異味的外來細(xì)菌利用凝乳中殘留的糖作底物（例如異發(fā)酵乳酸短桿菌），進(jìn)而避免導(dǎo)致干酪品質(zhì)下降。

蛋白質(zhì)水解是干酪成熟過程中發(fā)生的3個基本生化反應(yīng)中最重要而且最復(fù)雜的一個途徑。主要包括以下兩步：一是蛋白質(zhì)降解（蛋白質(zhì)水解、肽水解），二是游離氨基酸降解為風(fēng)味物質(zhì)，其中第二步是風(fēng)味形成的關(guān)鍵。

蛋白質(zhì)水解是多種酶參與的反應(yīng)，包括凝乳酶、自身的胞漿素、來源于發(fā)酵劑和非發(fā)酵劑乳酸菌的微生物蛋白酶與肽酶。發(fā)酵劑將牛乳中的酪蛋白降解成能被細(xì)胞吸收的肽類和游離氨基酸[9]。酪蛋白的水解是由添加的凝乳劑催化，而LAB蛋白酶和肽酶主要生成水溶縮氨酸和自由氨基酸。在這個反應(yīng)中產(chǎn)生的一些低分子量的苦味肽會直接影響干酪風(fēng)味。釋放的游離氨基酸也會影響干酪風(fēng)味，它們是產(chǎn)生干酪主要風(fēng)味物質(zhì)的前體。例如，谷氨酸鹽和天冬氨酸殘基可以增加風(fēng)味。LAB作為初發(fā)酵劑在很多種干酪中得到應(yīng)用，揭示這些微生物的蛋白水解體系是干酪成熟中的關(guān)鍵步驟。

氨基酸的分解代謝產(chǎn)生很多種物質(zhì)，主要包括氨、胺、乙醛、苯酚、吲哚和乙醇，這些物質(zhì)整體上有助于干酪風(fēng)味的形成。實(shí)驗(yàn)證明：LAB將自由氨基酸轉(zhuǎn)化為芳香氨基酸是干酪風(fēng)味產(chǎn)生的關(guān)鍵步驟。氨基酸分解作用的產(chǎn)物會形成風(fēng)味，這些分解作用包括脫羧、脫氨、轉(zhuǎn)氨、脫硫和側(cè)鏈水解。研究LAB分解代謝氨基酸都是針對芳香族、枝鏈及含硫氨基酸的降解物，因?yàn)樗鼈冊跉馕吨衅痍P(guān)鍵作用。例如，蛋氨酸轉(zhuǎn)化為含硫揮發(fā)性化合物，這使得許多干酪制品含有特殊的風(fēng)味。

脂肪酶或酯酶作用于奶脂肪產(chǎn)生的脂肪酸也直接影響干酪的風(fēng)味，并且作為酯和其他風(fēng)味成分的前體進(jìn)一步發(fā)揮作用。而且酯酶和脂肪酶催化酯的水解與合成，主要取決于干酪中水的活性和其他可利用的脂肪酸及乙醇的水平。這些酶可能來自凝乳酶漿、牛奶本身及發(fā)酵劑和非發(fā)酵劑中的LAB。例如，反芻動物乳中的脂肪酶和酯酶能產(chǎn)生某些意大利干酪所特有的氣味。但是，用脫脂乳制成的硬質(zhì)意大利干酪中，沒有使用脂肪酸酶和酯酶，與脂類分解作用有關(guān)的風(fēng)味可能是由于本土的牛奶中的酶和微生物酶的作用。大多數(shù)LAB缺乏分解脂肪的活性，但是如果干酪成熟時間長，這些細(xì)菌可以生成足夠的自由脂肪酸和酯，從而影響風(fēng)味。

最后，LAB利用檸檬酸鹽產(chǎn)生琥珀酸鹽或聯(lián)乙醯。琥珀酸鹽是一種類似谷氨酸鈉物質(zhì)，可提高干酪中的風(fēng)味，可以從幾種干酪中分離。從感官評價的研究結(jié)果表明琥珀酸鹽使得瑞士干酪風(fēng)味易于被大眾接受，同時也使切達(dá)干酪產(chǎn)生特有的風(fēng)味。瑞士干酪和其他干酪中，費(fèi)氏丙酸桿菌亞種、丙酸桿菌的數(shù)目很多，琥珀酸產(chǎn)物主要參與丙酸菌中的天冬氨酸代謝。但是，在切達(dá)干酪和其他干酪中，NSLAB通過還原性三羧酸循環(huán)將檸檬酸鹽轉(zhuǎn)化為琥珀酸鹽。

另一個重要的源自檸檬酸的風(fēng)味成分——聯(lián)乙醯，它在黃油、酪乳和一些干酪制品中的重要性已經(jīng)得到公認(rèn)。聯(lián)乙醯由-乙酰乳酸氧化分解形成，-乙酰乳酸是丙酮酸鹽代謝和氨基酸生物合成的中介。近幾年，對檸檬酸鹽代謝和聯(lián)乙醯產(chǎn)物的深入研究，使得可以有效控制乳球菌以提高聯(lián)乙醯產(chǎn)量。

4 結(jié)束語

綜上所述，乳酸菌基因組學(xué)的研究可以拓寬對乳酸菌的認(rèn)識，從微觀角度理解乳酸菌及其功能基因，揭示乳酸菌的遺傳和代謝機(jī)制，為闡明LAB影響干酪風(fēng)味的基礎(chǔ)機(jī)制奠定基礎(chǔ)，這將有利于乳制品企業(yè)在生產(chǎn)過程中提高干酪風(fēng)味。隨著乳酸菌基因組學(xué)一級相關(guān)交叉學(xué)科（如生物信息學(xué)和計(jì)算機(jī)學(xué)等）的進(jìn)一步發(fā)展，將極大的推進(jìn)乳酸菌應(yīng)用于干酪生產(chǎn)以提高干酪的風(fēng)味。

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Relationship between Lactic Acid Bacteria genomics and cheese flavor

CHEN Qi1，MA Yan-fen2，WANG Li1
（1 Research Center of Molecular Biology,Inner Mongolia Medical College，Hohhot 010059，China;2 Animal Nutrition Institute,Inner Mongolia Academy of Animal Science，Huhhot 010030，China）

This paper has reviewed the genomics of LAB,the relationship between LAB and cheese flavor and the mechanism of Cheese Ripening.These studies will contribute to reveal the genetic and metabolic mechanisms of Lactic Acid Bacteria,promote the finding of important functional genes,and provide the basis for applying LAB into cheese production.

Lactic Acid Bacteria；Genomics；cheese；flavor

Q966,TS252.53

B

1001-2230（2011）10-0040-04

2011-07-21

內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院博士啟動金（nybq2010cq）。

陳琦（1980-），女，副研究員，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)與基因組學(xué)。