摘要:利用L9(34)正交試驗，研究了淀粉量、小牛血清比例和初始pH值3個因素對結腸小袋纖毛蟲在RPMI 1640培養(yǎng)基中最高種群密度的影響。方差分析結果表明，初始pH值對最高種群密度影響最大，其次為小牛血清比例，淀粉量影響最小。最佳培養(yǎng)基組成為淀粉40mg/瓶、血清25%(RPMI 1640培養(yǎng)液2.25mL+小牛血清0.75mL);最適宜的RPMI 1640培養(yǎng)液初始pH值為7.0。

關鍵詞:結腸小袋纖毛蟲;正交試驗;RPMI 1640培養(yǎng)基

中圖分類號:S852.72+4文獻標識碼:A文章編號:1007-273X(2010)08-0006-02

結腸小袋纖毛蟲病(Balantidiosis)是由結腸小袋纖毛蟲(Balantidium coli)引起的人畜共患寄生蟲病，呈世界性分布，主要流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)。目前已知有人及33種動物可以感染該病。人感染后在臨床上可表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、里急后重等癥狀，有些病例還可表現(xiàn)為泌尿生殖道感染，對人體健康危害較大[1]。豬結腸小袋纖毛蟲感染非常普遍，感染率可高達20%～100%[2]。目前，國內(nèi)外對結腸小袋纖毛蟲的研究主要集中在流行病學的調(diào)查、臨床病例的診斷和治療等方面，而其致病機理仍然不明，因此，有必要通過其體外培養(yǎng)體系的建立，進行該蟲的生物學、致病機制、免疫及藥物篩選等研究[3]。RPMI 1640培養(yǎng)基常用于細胞培養(yǎng)，而結腸小袋纖毛蟲是單細胞的原生動物，初步試驗表明，在RPMI 1640培養(yǎng)基中加入適量淀粉、小牛血清可用于結腸小袋纖毛蟲的培養(yǎng)，為進一步優(yōu)化培養(yǎng)基組成，進行了正交試驗。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1蟲種采自洛陽市孟津縣某豬場自然發(fā)病的病豬糞便，直接鏡檢發(fā)現(xiàn)有大量滋養(yǎng)體。取糞便樣少許接種于改進型RSS培養(yǎng)基，在28℃條件下培養(yǎng)48h，鏡檢后發(fā)現(xiàn)大量活動滋養(yǎng)體后用于試驗[4]。

1.1.2試劑RPMI 1640培養(yǎng)基，10.4g裝，Lot

No.2535081，GIBCOTM;小牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司生產(chǎn)，批號為090324;碳酸氫鈉，西安化學試劑廠生產(chǎn)，批號為080423，分析純;可溶性淀粉，北京海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基廠生產(chǎn)，批號080417，用前取適量裝入潔凈小瓶中高壓滅菌;青霉素和鏈霉素(用前用pH值為7.0的0.1MPBS分別稀釋成20萬IU/mL)。

1.2方法

1.2.1RPMI 1640培養(yǎng)基配制 RPMI 1640培養(yǎng)基用無菌雙蒸餾水溶解，每1 000mL加2.0g NaHCO3。培養(yǎng)基用G6濾器除菌，4℃保存，使用前根據(jù)需要用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)整pH值。

1.2.2正交試驗設計根據(jù)以往的工作經(jīng)驗，選影響蟲體繁殖的淀粉量、小牛血清比例和初始pH值3個因素進行試驗，每個因素選3個水平，利用L9(34)正交表，考查上述3個因素對結腸小袋纖毛蟲體外繁殖性能的影響。具體試驗方案見表1，為保證試驗結果的重復性，每個試驗組設計兩個平行樣品，進行有重復觀測值正交試驗[5]。

1.2.3蟲體接種及結果觀察本試驗用安瓿瓶進行培養(yǎng)，每個安瓿瓶內(nèi)液體總量為3mL，按比例加入相應pH值的RPMI1640培養(yǎng)基和小牛血清，并加入相應量的淀粉。一個試驗號設兩個平行樣品，分別進行標記，作為單位組Ⅰ和單位組Ⅱ進行統(tǒng)計分析。培養(yǎng)基制備完成后，每個安瓿瓶內(nèi)滴加青霉素和鏈霉素各1萬IU/mL。每個安瓿瓶內(nèi)加結腸小袋纖毛蟲滋養(yǎng)體懸液100μL。檢查初始密度后，將安瓿瓶加蓋后放入28℃條件下培養(yǎng)，每12h檢查一次，直至樣品種群密度連續(xù)兩次下降為止。檢查時，將每一個樣品混勻后取40μL，滴于載玻片上，蓋上蓋玻片(18mm×18mm)，于100×鏡暗視野下檢查，計數(shù)30個視野下的蟲體數(shù)。

1.2.4數(shù)據(jù)分析以每一個安瓿瓶內(nèi)最高種群密度為基本數(shù)據(jù)，利用有重復觀測值正交試驗方差分析法進行結果分析，考查不同因素各水平對獲得最高密度的影響，同時，利用多重比較(SSR法)確定某一因素3個水平中最佳水平，最后確定培養(yǎng)基最佳組成。

2結果

2.1試驗結果

在初始接種量均為8個/30個視野的情況下， 除試驗號3、5、7種群密度在接種培養(yǎng)后108h達到最高值外，其余樣品均于96h達到密度最高值。L9(34)正交試驗結果見表2。

2.2方差分析

由表2的極差可以看出，3個因素對獲得最高種群密度的影響主次順序為C(初始pH值)、B(小牛血清比例)和A(淀粉量)。對表2的結果進行方差分析，其結果見表3。由于MSe1/MSe2>1，MSe1與MSe2差異顯著，以MSe2進行F檢驗和多重比較。F檢驗結果表明，淀粉量、血清比例及初始pH值對獲得最高種群密度均有極顯著影響(P<0.01)。兩個單位組間差異不顯著(P>0.05)。

2.3各因素不同水平下最高種群密度平均數(shù)的多重比較

利用SSR法對各因素不同水平下最高種群密度平均數(shù)進行了多重比較，結果見表4、表5及表6。40mg/安瓿(A3)條件下所獲得的最高種群密度極顯著高于30mg/安瓿(A2)及20mg/安瓿(A1)(P<0.01)，而后兩者差異不顯著(P>0.05)。血清比例為25%(B3)的條件下所獲得的最高種群密度顯著高于20%(B2)(P<0.05)，極顯著高于15%(B1)(P<0.01)，后兩者差異極顯著(P<0.01)。初始pH為7.0(C2)條件下所獲得的最高種群密度極顯著高于6.0(C1)及8.0(C3)(P<0.01)，后兩者差異也極顯著(P<0.01)。

2.4最佳培養(yǎng)基組成的確定

根據(jù)總體分析結果，A因素各水平中A3最好，B因素中B3最好，C因素中C2最好，因此最優(yōu)組合為A3B3C2，即淀粉量為40mg/安瓿，血清量為25%，初始pH值為7.0。

3討論

RPMI 1640含有較為豐富的營養(yǎng)成分，加一定比例的血清可用于細胞培養(yǎng)，但利用此培養(yǎng)基培養(yǎng)結腸小袋纖毛蟲國內(nèi)外尚未見報道[3]。在初步試驗時，用此培養(yǎng)基培養(yǎng)結腸小袋纖毛蟲，蟲體密度在小幅度增長后很快衰落。后來在培養(yǎng)基中加入適量的淀粉，則蟲體可以很好地生長繁殖。為了取得良好的培養(yǎng)基組成，本試驗利用正交試驗研究了結腸小袋纖毛蟲在RPMI 1640培養(yǎng)基上再培養(yǎng)效果，并進行了有重復觀測值的方差分析，最終確定了最佳培養(yǎng)基組成。在上述因素中，培養(yǎng)液初始pH值是最大的影響因素，在初始pH值設定為7.0時所取得的最高種群密度顯著高于6.0和8.0，這與利用RSS或改進型RSS培養(yǎng)基培養(yǎng)時的pH值為7.0～7.5要求基本一致[4，6]。所不同的是，利用RSS或改進型RSS培養(yǎng)基培養(yǎng)時初始pH值為6.5及8.0時，蟲體在初期少量增殖后密度迅速下降，表現(xiàn)明顯的不適應性，而本次試驗發(fā)現(xiàn)，在這兩種初始pH值條件下，蟲體仍然有一定繁殖能力，其原因有待進一步研究[7]。

利用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)結腸小袋纖毛蟲比RSS或改進型RSS培養(yǎng)基具有更多優(yōu)點。RPMI 1640培養(yǎng)基配制及使用方便，在適宜的pH值條件下，可獲得較高的種群密度，最高種群密度可達500個以上/30個視野，而在RSS或改進型RSS培養(yǎng)基上最高僅可獲得200個左右/30個視野[4，6]，因此，在今后的研究中，可用RPMI 1640培養(yǎng)基取代RSS或改進型RSS培養(yǎng)基進行結腸小袋纖毛蟲的體外培養(yǎng)。

參考文獻:

[1]蔣金書.動物原蟲病學[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2000. 329-333.

[2]SOLAYMANI M S，PETRI W A J. Zoonotic Implications of the Swine-transmitted Protozoal Infections [J]. Veterinary Parasitology，2006，140: 189-203.

[3]SCHUSTER F L，LYNN R A. Current world status of Balantidium coli[J]. Clinical Microbiology Reviews，2008，21(4): 626-638.

[4]王天奇，丁軻，張玲，等.改進型RSS培養(yǎng)基體外培養(yǎng)結腸小袋纖毛蟲的效果研究[J].湖北畜牧獸醫(yī)，2008(10):6-8.

[5]明道緒.生物統(tǒng)計附試驗設計[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.311-314.

[6]王天奇，閆文朝，丁軻，等.RSS培養(yǎng)基體外培養(yǎng)結腸小袋纖毛蟲的效果觀察[J].中國獸醫(yī)寄生蟲病，2008，16(6):17-21.

[7]張紹麗，馬洪鋼，宋微波.海洋纖毛蟲—巨大擬阿腦蟲的實驗生態(tài)學研究Ⅲ.pH對種群生長的影響[J].應用與環(huán)境生物學報，2001，7(3):244-247.