摘要：1.3％瓊脂糖凝膠和5％聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)核桃RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)的結(jié)果表明。5％聚丙烯酰胺凝膠對(duì)RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物的分離效果較1.3％瓊脂糖凝膠好。根據(jù)兩者的電泳結(jié)果構(gòu)建了樹狀聚類圖，聚類結(jié)果大致相同，兩種電泳方法都能正確地反映出品種間的遺傳關(guān)系。通過挑選20個(gè)片段進(jìn)行克隆，發(fā)現(xiàn)20條序列都來自核桃基因組。其中，編碼蛋白基因的序列為5條，占所克隆片段的25％。

關(guān)鍵詞：核桃；RAPD；瓊脂糖凝膠電泳；聚丙烯酰胺凝膠電泳；序列特點(diǎn)

中圖分類號(hào)：Q503 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942(2010)10-0001-06

核桃(Juglans regia L)屬于胡桃科核桃屬，是我國(guó)栽培歷史悠久、分布廣泛的重要速生林業(yè)用材和可食性堅(jiān)果樹種，其種仁除含脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物外，還含鈣、磷、鐵、胡蘿卜素、硫胺素、核黃索和尼克酸等多種成分，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，有“21世紀(jì)超級(jí)食品”的美譽(yù)。我國(guó)是核桃屬的分布中心區(qū)，也是核桃的原產(chǎn)地，核桃種質(zhì)資源豐富，品種繁多，共記載品種有860多種，具有重要的生物學(xué)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。核桃種質(zhì)資源遺傳多樣性研究是核桃種質(zhì)資源學(xué)研究的重要內(nèi)容和核桃新品種選育的理論基礎(chǔ)。利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)核桃資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，可為資源的保護(hù)和利用提供可靠有效的理論依據(jù)，還可以搞清楚核桃種質(zhì)資源內(nèi)的物種關(guān)系，為核桃遺傳育種及遺傳規(guī)律的研究奠定基礎(chǔ)。另外，與其它大多數(shù)林木樹種相比，核桃通常作為果樹進(jìn)行栽培，生產(chǎn)中對(duì)其品種純度的要求和果樹一樣高，理論上。相同品種的遺傳背景完全一致，因此核桃品種的鑒定對(duì)于苗木純度分析以及品種產(chǎn)權(quán)保護(hù)具有重要意義。建立簡(jiǎn)便、快速、高效的核桃品種鑒定的技術(shù)體系具有必要性。

RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)，即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA，是分子標(biāo)記的一種，具有模板DNA量少(15-25ng)、無(wú)或少污染、費(fèi)用較低、實(shí)驗(yàn)設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單、技術(shù)簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，且無(wú)需預(yù)先了解DNA模板的序列，在對(duì)遺傳背景所知甚少的物種遺傳分析方面具有特殊優(yōu)勢(shì)。目前已經(jīng)有RAPD用于核桃遺傳多樣性分析方面的文章報(bào)道，但是對(duì)于RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物的繼續(xù)深入分析，除了轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記外，對(duì)于其性質(zhì)目前還缺乏充分的認(rèn)識(shí)。而聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel，PAG)電泳比瓊脂糖凝膠電泳具有上樣量少、分辨率高、顯示信息完全等優(yōu)點(diǎn)，有利于擴(kuò)增產(chǎn)物的后續(xù)分析。迄今，將聚丙烯酰胺凝膠電泳應(yīng)用于核桃RAPD中的研究還未見報(bào)道。本研究建立在已有的核桃RAPD反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，利用16份重要的核桃品種進(jìn)行RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳比較，為RAPD技術(shù)在核桃中的科學(xué)與合理利用提供依據(jù)。同時(shí)，我們對(duì)20個(gè)隨機(jī)擴(kuò)增片段的序列進(jìn)行了測(cè)序分析，為更好地認(rèn)識(shí)RAPD技術(shù)的實(shí)質(zhì)以及該技術(shù)在核桃品種鑒定和遺傳分析等方面的合理利用提供理論依據(jù)。

1、材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料來自山東省果樹研究所試驗(yàn)五分場(chǎng)的國(guó)家核桃資源圃內(nèi)，共16個(gè)樣本。編號(hào)及名稱見，表1。

1.2 DNA提取

采用張虎平等的改良CTAB法從核桃幼葉中提取基因組DNA，利用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，Eppendoff公司生產(chǎn)的Bio-Photometer核酸檢測(cè)儀檢測(cè)DNA溶液濃度與純度，最終將濃度稀釋至30ng/μl。

1.3 引物篩選

采用上海英駿生物技術(shù)公司生產(chǎn)的11個(gè)堿基的隨機(jī)引物，利用德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn)的Mastercycler ep gradient普通梯度PCR儀連續(xù)兩次PCR梯度篩選，可產(chǎn)生清晰且擴(kuò)增穩(wěn)定的引物。

反應(yīng)體系為15μl，包括ddH₂O 8.3μl，10×Buffer 1.5μl，25 mmol/L Mg²⁺1.2μl，2.5 mmol/LdNTPs1.8μl，10 pmol/μl引物1.2山，30 ng/μl模板DNA lμl，5 U/μlDNA polymerase 0. 08μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；然后94℃變性50 s，35-45℃復(fù)性1min 20s，72℃延伸2min，共43個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，結(jié)束后保存在4℃條件下。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.3％瓊脂糖凝膠中電泳30-40min，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察拍照。選擇擴(kuò)增條帶清晰不彌散且穩(wěn)定的溫度作為PCR擴(kuò)增的最適退火溫度。

1.4 PCR擴(kuò)增

反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同引物篩選部分，不同引物根據(jù)表2中所列的退火溫度依次更改。

1.5 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

瓊脂糖凝膠電泳同引物篩選部分所述，聚丙烯酰胺凝膠電泳采用5％非變性聚丙烯酰胺凝膠在北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-Ⅱ型垂直板電泳儀及DYC-30型電泳槽中進(jìn)行。上樣完畢后在200V、100mA電流條件下電泳90min。電泳結(jié)束后進(jìn)行銀染，參考霍金龍等的方法。

1.6 片段回收克隆

從PAGE膠中割取目標(biāo)片段，放入1.5ml離心管中，加100μl雙蒸水洗滌兩次，離心并吸去雙蒸水，加入1×PCR Buffer 100μl和25 mmol/LMg²⁺8μl，并用吸頭尖將凝膠碾碎，37℃下水浴5h。水浴結(jié)束后離心，然后吸取1μl上清液作為模板，并加入ddH₂O 8.3μl，10×Buffer1.5μl，25mmol/L Mg²⁺1.2μl，2.5 mmol/L dNTPs 1.8μl，10 pmol/μl引物1.2μl，5U/μl DNA polymerase0.08μl進(jìn)行PCR檢測(cè)，反應(yīng)程序同原引物的擴(kuò)增程序。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以鑒定擴(kuò)增條帶的特異性。

回收檢測(cè)后，將瓊脂糖上的特異片段割下，利用Axygen公司生產(chǎn)的AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收特異片段，回收方法參照說明書。

回收后進(jìn)行克隆，參照Sambrook等的步驟進(jìn)行。克隆后由南京金斯特公司進(jìn)行測(cè)序。

本研究中，考慮到測(cè)序效率，主要對(duì)長(zhǎng)度為0.3-1.0kb的電泳片段進(jìn)行回收與克隆。

1.7 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)9個(gè)能產(chǎn)生多態(tài)位點(diǎn)的引物在16個(gè)DNA樣品中擴(kuò)增的電泳帶總數(shù)與多態(tài)帶的數(shù)目(見表2)。在電泳圖譜的同一RAPD位點(diǎn)上有電泳帶記錄為1，無(wú)電泳帶記錄為0。作(0，1)矩陣圖輸入計(jì)算機(jī)。采用Popgene和treeview軟件，計(jì)算遺傳距離(GD)和Nei’s遺傳相似性系數(shù)(GS)，根據(jù)UPGMA方法構(gòu)建聚類樹狀圖。

測(cè)序后的結(jié)果使用BioXM軟件去除載體序列部分，在NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)上利用Blast(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行比對(duì)分析。

2、結(jié)果與分析

2.1 電泳結(jié)果比較

理論上，電泳系統(tǒng)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分辨能力越高，展示越充分，就越能真實(shí)地反映出檢測(cè)物種的遺傳信息。我們采用聚丙烯酰胺凝膠電泳和瓊脂糖凝膠電泳兩種方式對(duì)核桃RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)盡管兩種電泳系統(tǒng)都能獲得清晰的條帶(圖1、圖2)，但得到的譜帶數(shù)卻不盡相同。

統(tǒng)計(jì)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(表2)顯示，9條引物在16個(gè)核桃品種中共擴(kuò)增出56條清晰的條帶，其中多態(tài)性條帶為38條，多態(tài)性比例為67.7％，平均每條引物擴(kuò)增出6.2條條帶，其中多態(tài)性條帶4.2條。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為240-2000bp。統(tǒng)計(jì)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果(表2)顯示，共擴(kuò)增出122條清晰的條帶，其中多態(tài)性條帶為99條，多態(tài)性比例為80.9％；平均每條引物擴(kuò)增出13.6條帶，其中多態(tài)性條帶11條。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為200-2000bp。引物Y17通過瓊脂糖凝膠共擴(kuò)增出10條帶，多態(tài)性條帶為9條，多態(tài)性比例為90％，而在聚丙烯酰胺凝膠則分別為17、17、100％。

從兩種電泳的統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，瓊脂糖凝膠電泳的RAPD譜帶平均包含約2條PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，說明瓊脂糖凝膠上的一條帶很可能是因?yàn)閹讞l帶在瓊脂糖凝膠上發(fā)生共遷移現(xiàn)象而形成的共有帶，共遷移現(xiàn)象明顯。

2.2 品種遺傳關(guān)系結(jié)果比較

圖3、4為根據(jù)遺傳距離，利用UPGMA方法構(gòu)建的瓊脂糖凝膠聚類圖和聚丙烯酰胺凝膠聚類圖，16個(gè)品種都得到了很好的區(qū)分，兩者均能對(duì)所有品種進(jìn)行正確的聚類。兩者的聚類結(jié)果基本相似，所有的品種均被分為兩個(gè)大群，第一個(gè)大群為意大利、元豐、魯核l號(hào)、遼核2號(hào)、岱香、N12-6、S1-19、S13-7、S11-8、魯光、魯香，其余為第二大群。在第一大群中，除了意大利以外，其余品種都屬于新疆早實(shí)群體；而第二大群的品種則屬于晚實(shí)品種以及麻核桃類。但是第二大群中麻核桃品種(磨盤、野雞心)與晚實(shí)核桃(禮品2號(hào)、晉龍1號(hào)、西洛2號(hào))在聚丙烯酰胺凝膠聚類圖中得到了很好的區(qū)分，而在瓊脂糖凝膠聚類圖中沒有很好地區(qū)分開。

兩種電泳方式的比較說明，PAGE膠比瓊脂糖膠聚類的精準(zhǔn)度更高，所反映出的核桃品種的遺傳相似性水平更為科學(xué)，這與其分離能力高有著直接的關(guān)系，但是瓊脂糖凝膠電泳具備操作簡(jiǎn)單與便于觀察等方面的特點(diǎn)。因此應(yīng)該針對(duì)不同的試驗(yàn)要求選擇不同的電泳方式。

2.3 RAPD的PCR產(chǎn)物特點(diǎn)

從PAGE膠中隨機(jī)割取20個(gè)片段，進(jìn)行回收、克隆測(cè)序后發(fā)現(xiàn)：在克隆片段序列的兩端都發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的引物序列，說明20個(gè)片段都來自于核桃基因組，證明了RAPD的PCR擴(kuò)增的特異性與準(zhǔn)確性。不同品種相同片段的序列分析表明，它們是不同品種基因組上相同位點(diǎn)的序列，表明PAGE電泳不存在或少有共遷移性現(xiàn)象。

將20條序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)后(表3)發(fā)現(xiàn)：其中有1條序列編碼多藥耐藥蛋白。該序列全長(zhǎng)為437bp，兩端均存在引物序列(5ˊ-AGCGTCCTCCG-3ˊ)，其堿基比例為A+T=55.15％，C+G=44.85％(圖5)?？梢酝茢嘣撈尉哂芯幋a多藥耐藥蛋白基因的部分序列。另外，有4條序列能編碼假定蛋白，剩余15條序列比對(duì)結(jié)果顯示同源性結(jié)果較低，可能是非編碼序列或者是核桃上尚未發(fā)現(xiàn)的新基因。所有序列的比對(duì)結(jié)果說明了RAPD不僅擴(kuò)增非編碼基因序列，而且也擴(kuò)增編碼蛋白的基因片段。

3、結(jié)論與討論

由于近年來核桃產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展壯大，核桃無(wú)性系品種的推廣和深入，以及資源環(huán)境的破壞，核桃品種有朝單一性方面發(fā)展的趨勢(shì)，種質(zhì)資源研究的重要性也引起越來越多人的重視。分子標(biāo)記可以為種質(zhì)資源的研究提供幾乎無(wú)限的多態(tài)性證據(jù)，通過分子標(biāo)記進(jìn)行資源鑒別，也可以避免資源保存中經(jīng)常發(fā)生的資源混淆，為種質(zhì)資源保存提供科學(xué)依據(jù)，有效地解決品種單一性發(fā)展的問題。AFLP、RAPD、SSR等DNA分子標(biāo)記也常常被用于果樹品種鑒定以及遺傳多樣性研究。而RAPD具有技術(shù)簡(jiǎn)便、費(fèi)用較低、所需試驗(yàn)設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。已見報(bào)道的利用RAPD分子標(biāo)記來研究核桃遺傳多樣性的文章中，都是采用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，而用聚丙烯酰胺凝膠電泳的卻未見報(bào)道。

本研究采用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩種不同的電泳方式，通過對(duì)16個(gè)核桃品種的電泳分析發(fā)現(xiàn)，兩種不同的電泳方式都能對(duì)16個(gè)核桃品種進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分，但在同等條件下，PAGE膠的分離能力明顯強(qiáng)于瓊脂糖凝膠，而瓊脂糖凝膠上的一條帶很有可能是幾條尚未跑開的條帶重合在一起，存在著共遷移現(xiàn)象。PAGE膠雖然分辨能力高，但是與瓊脂糖凝膠相比，存在著制膠不簡(jiǎn)便、處理步驟多、時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，因此，考慮到實(shí)驗(yàn)要求和效率等方面的因素，我們建議在對(duì)核桃種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳分析以及鑒別大量品種或親緣關(guān)系較近品種時(shí)優(yōu)先選用PAGE-RAPD，從而達(dá)到更真實(shí)反映種質(zhì)資源問的遺傳基礎(chǔ)以及高效、有效鑒定品種的目的。不過，瓊脂糖凝膠電泳的RAPD技術(shù)體系更方便與簡(jiǎn)易，仍是品種快速鑒定的好方法，在鑒別大量品種時(shí)，可以通過增加引物數(shù)量來增加多態(tài)性譜帶的數(shù)量而達(dá)到鑒別效果。

本研究同時(shí)對(duì)20個(gè)隨機(jī)選取的聚丙烯酰胺凝膠電泳片段進(jìn)行回收、克隆并測(cè)序，發(fā)現(xiàn)20個(gè)隨機(jī)產(chǎn)物都是從核桃基因組上隨機(jī)擴(kuò)增得到的，其中有5條序列能編碼蛋白。進(jìn)一步驗(yàn)證了RAPD技術(shù)用于遺傳多樣性研究的準(zhǔn)確性與可靠性。

因此，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模羞x擇性地采用合適的電泳方式，對(duì)于快速、準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)具有重要的意義。

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