陳德堅(jiān)，黃春新，陳 萍，王 芳，林 蓉

（海南省人民醫(yī)院藥學(xué)部，海南 ?？?570311）

新磺棕小兒止咳合劑是醫(yī)院的生產(chǎn)制劑，處方主要成分有磺胺甲噁唑、甲氧芐胺嘧啶、復(fù)方甘草合劑等。臨床上用于消炎、化痰、止咳，是兒科的常用制劑。根據(jù)2005年版《中國(guó)藥典》要求，具有抑菌活性的供試品，應(yīng)消除供試品的抑菌活性后再依法檢查。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)中和法和薄膜過(guò)濾法消除供試品的抑菌活性后，用5株代表菌做微生物計(jì)數(shù)的菌回收率試驗(yàn)及控制菌檢出率測(cè)定，探討該方法的可行性?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與儀器

1.1 藥品 新磺棕小兒止咳合劑（規(guī)格：60ml/瓶，批號(hào)：20090102，20090106，20090109），由海南省人民醫(yī)院制劑中心配制。

1.2 培養(yǎng)基、菌種及來(lái)源 培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂，批號(hào)：0611287；玫瑰紅鈉瓊脂，批號(hào)：0705116；膽鹽乳糖培養(yǎng)基，批號(hào)：0701100，由北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司提供；MUG培養(yǎng)基，批號(hào)：0701036，由北京牛?；蚣夹g(shù)有限公司提供。陽(yáng)性對(duì)照菌：大腸埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44102］、金黃色葡萄球菌（Staphy-lococcus aureus）［CMCC（B）26003］、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［CMCC（B）63501］、白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98001］、黑曲霉CMCC（F）98003，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

1.3 儀器 DSX—3型高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；PYX—250S—A型生化培養(yǎng)箱（廣東韶關(guān)科力實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；凈化工作臺(tái)（上海匯龍儀表電子有限公司）；PYX—250M—A霉菌培養(yǎng)箱（廣東韶關(guān)科力實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；HTY反復(fù)使用過(guò)濾器（杭州高得醫(yī)療器械有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

2.1.1 取經(jīng)37℃培養(yǎng) 18-24h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的肉湯培養(yǎng)物各1ml，加9ml滅菌生理鹽水，10倍稀釋至10-6，細(xì)菌數(shù)約為50-100cfu，做活菌計(jì)數(shù)備用。

2.1.2 取經(jīng)25℃培養(yǎng) 18-24h的白色念珠菌培養(yǎng)物1ml，加9ml滅菌生理鹽水，10倍稀釋至10-5，細(xì)菌數(shù)約為50-100cfu，做活菌計(jì)數(shù)備用。

2.1.3 取經(jīng)25℃培養(yǎng) 1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物加3-5ml滅菌生理鹽水洗下霉菌孢子，吸取出菌液1ml，加入滅菌生理鹽水9ml，10倍稀釋至10-4，菌數(shù)約為50-100cfu，做活菌計(jì)數(shù)備用。

2.1.4 供試品溶液的制備 本品放置5min后取上清液10ml，加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨稀釋液至100ml，作為1∶10的供試液。

2.2 抑菌性試驗(yàn)［2］用需氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基6管及真菌培養(yǎng)基4管分別接種規(guī)定量（50-100cfu）的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各兩管，均在規(guī)定的溫度下培養(yǎng)7d。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 抑菌性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of antibacterial test

從表1結(jié)果可知，含供試品的培養(yǎng)管與未加供試品的培養(yǎng)管比較，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌不生長(zhǎng)；白色念珠菌、黑曲霉菌能生長(zhǎng)。說(shuō)明該供試品對(duì)細(xì)菌有很強(qiáng)的抑菌作用，但對(duì)霉菌、酵母菌無(wú)抑菌作用。

2.3 細(xì)菌數(shù)檢查方法的研究

2.3.1 試驗(yàn)組 取1∶10的供試液1ml，薄膜過(guò)濾，以0.1％蛋白胨水溶液為沖洗液沖洗，每次100ml，共制備3組，每組在最后一次沖洗液中加入1％對(duì)氨基苯甲酸溶液10ml，反應(yīng)30min，然后分別加入金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌液各1ml，過(guò)濾后取出濾膜，分別貼于營(yíng)養(yǎng)平皿中于30-35℃培養(yǎng)。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.2 菌液組 取試驗(yàn)菌1ml，采用平皿法，每種試驗(yàn)菌均做兩份平行試驗(yàn)。

2.3.3 供試品對(duì)照組 不加菌液，其他操作同試驗(yàn)組，測(cè)量樣品本底菌數(shù)。

2.3.4 稀釋劑對(duì)照組 取0.1％蛋白胨水溶液1ml，薄膜過(guò)濾，同上操作。

表2 薄膜法測(cè)定3種陽(yáng)性菌回收率試驗(yàn)結(jié)果Tahle 2 The recovery test results using Filtration m emb ranem ethod

從表2結(jié)果可知，取1：10供試液1ml按照中和法和薄膜過(guò)濾法處理，當(dāng)沖洗量為500ml并加1％對(duì)氨基苯甲酸溶液10ml時(shí)，結(jié)果人工污染大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌試驗(yàn)組的菌回收率均大于70％，符合中國(guó)藥典2005年版驗(yàn)證的要求。

2.4 霉菌和酵母菌檢查的研究

2.4.1 試驗(yàn)組 按照平皿法，取兩組平皿，每組2個(gè)，分別加入1∶10供試液1ml，然后每組分別加入白色念珠菌和黑曲霉菌各1ml，傾注20ml玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，靜置放冷后于23-28℃培養(yǎng)72h。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4.2 菌液組 取試驗(yàn)菌1ml，采用平皿法，每種試驗(yàn)菌均做兩份平行試驗(yàn)。

2.4.3 供試品對(duì)照組 不加菌液，其他操作同試驗(yàn)組，測(cè)量樣品本底菌數(shù)。

表3 霉菌和酵母菌回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The recovery test results of molds and saccharomycetes

從表3結(jié)果可知，取1：10供試液1ml按照平皿法進(jìn)行處理，結(jié)果人工污染白色念珠菌和黑曲霉菌試驗(yàn)組的菌回收率均大于70％，符合中國(guó)藥典2005年版驗(yàn)證的要求。

2.5 大腸埃希菌檢查

2.5.1 取1∶10供試液1ml薄膜過(guò)濾，以0.1％的蛋白胨水溶液為沖洗液沖洗，每次100ml，最后一次沖洗液中加入1％對(duì)氨基苯甲酸溶液10ml，反應(yīng)30min，濾膜取出放入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，制備兩組，其中一組加入大腸埃希菌1ml，作為試驗(yàn)組，另一組加入金黃色葡萄球菌液1ml，作為陰性對(duì)照組，兩組均置（36±1）℃溫度培養(yǎng)24h。

2.5.2 取上述培養(yǎng)物各0.2ml接種至5ml-MUG培養(yǎng)基試管內(nèi)，（36±1）℃培養(yǎng)，于5h、24h在365nm的紫外燈下觀察，同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基做本底對(duì)照。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 大腸埃希菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果Table 4 Recovery rate of Escherichia coliin the validation test

從表4結(jié)果可知，采用中和法和薄膜過(guò)濾法處理，沖洗量為500ml，并在最后一次沖洗液中加入1％對(duì)氨苯甲酸溶液10ml，反應(yīng)30min，試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，陰性對(duì)照組未檢出陰性對(duì)照菌，可滿足中國(guó)藥典2005年版驗(yàn)證要求。

3 結(jié)論

根據(jù)上述結(jié)果，新磺棕小兒止咳合劑微生物限度檢查中的細(xì)菌數(shù)檢查和控制細(xì)菌檢查可依據(jù)中國(guó)藥典微生物限度檢查方法中的中和法和薄膜過(guò)濾法處理，沖洗量至少為500ml，并在最后一次沖洗液中加入1％對(duì)氨苯甲酸溶液10ml，反應(yīng)30min。霉菌和酵母菌數(shù)檢查可依據(jù)中國(guó)藥典微生物限度檢查方法中的平皿法進(jìn)行。

4 討論

4.1 具有抑菌藥物的微生物限度檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性，主要取決于供試品本身在試驗(yàn)條件下是否抑制被檢微生物的生長(zhǎng)繁殖［3］。檢驗(yàn)時(shí)應(yīng)排除其抑菌作用，使之不干擾染菌的限度檢驗(yàn)。《中國(guó)藥典》規(guī)定細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證的菌回收率應(yīng)不低于70％。從上述結(jié)果可以看出，供試品對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用，采用中和法和薄膜過(guò)濾法進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照菌回收試驗(yàn)，菌回收率均大于70％，檢測(cè)結(jié)果符合要求。

4.2 菌懸液配制過(guò)程中，每一級(jí)稀釋液都應(yīng)充分振搖混勻，由于菌種為特殊活性的生物，許多因素都會(huì)影響到最終菌懸液配制濃度。因此，試驗(yàn)時(shí)應(yīng)確定相關(guān)參數(shù)（接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基的量）以便于更快找到所要的稀釋級(jí)。制備好的原菌懸液以當(dāng)天使用為宜，超過(guò)1周應(yīng)重新計(jì)數(shù)［4］。另外，菌懸液配置過(guò)程中試驗(yàn)者應(yīng)注意自我保護(hù)，防止感染。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典2005年版二部附錄［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005∶93.

［2］盧文斌.冰硼散微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證［J］.中國(guó)藥房，2007，18（18）∶1 396-1 397.

［3］向 東，范 兵，李紅纓.薄膜過(guò)濾法檢查蜂膠牙泰噴霧劑中微生物的限度［J］.華西藥學(xué)雜志，2006，21（3）∶299-300.

［4］馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊(cè)［M］.北京：科學(xué)出版社，2000∶62.