簡建波，鄒定輝，劉文華，朱喜鋒，劉慧慧

（1.汕頭大學 海洋生物研究所，廣東 汕頭 515063；2.華南理工大學 環(huán)境科學與工程學院，廣東 廣州 510006）

三角褐指藻對銅離子長期暴露的生理響應

簡建波1，鄒定輝2，劉文華1，朱喜鋒1，劉慧慧1

（1.汕頭大學 海洋生物研究所，廣東 汕頭 515063；2.華南理工大學 環(huán)境科學與工程學院，廣東 廣州 510006）

探討了不同濃度Cu2+長期暴露對三角褐指藻生長、光合作用、呼吸作用和色素含量等生理特性的影響。結果表明：三角褐指藻在較低濃度下 (0.25mg?L-1,0.5 mg?L-1) 生長受到刺激，而在高濃度下（1.5 mg?L-1）則下降。葉綠素熒光參數(shù)有效光化學效率（Yield）與最大光化學效率（Fv/Fm）對Cu2+非常敏感，它們均隨Cu2+的升高而顯著下降；Cu2+暴露對光合作用速率也具有抑制作用；而在Cu2+長期暴露下，類胡蘿卜素含量比對照組高，但提高的程度隨Cu2+濃度升高而下降。這些結果說明，葉綠素熒光參數(shù)可以作為三角褐指藻受到Cu2+脅迫的靈敏指標；光合作用與生長并不耦合；類胡蘿卜素含量和呼吸作用速率升高可能能夠降低Cu2+對三角褐指藻的毒性。

三角褐指藻；葉綠素熒光；光合作用；呼吸作用；Cu2+

Cu2+是工業(yè)用途中最常見的一類有毒重金屬，環(huán)境中銅的各種來源包括工業(yè)和生活垃圾、銅礦的排水、以銅為基礎的殺蟲劑和防污涂料的使用等，人類活動已經(jīng)引起了水生環(huán)境中銅含量的顯著增加[1-2]。有統(tǒng)計顯示，在世界范圍內每年人為排放的銅大概有35 × 103～ 90 × 103t[3]。Lucan-Bouch′e (1997)[4]發(fā)現(xiàn)在湖泊、河流、池塘中銅的積累濃度達到了3.0 mg·L-1。有調查表明，在近岸海域環(huán)境中的總Cu2+濃度為1 ～10 nmol·L-1，但是由于自然和人為因素，在沿岸和港灣海水中的總銅含量可能更高0.64 ～ 6.4 μg·L-1（10 ～100 nmol·L-1）[5]。中國近海岸環(huán)境質量報告顯示在部分地區(qū)重金屬銅含量介于海水水質標準的三類和四類(銅濃度≤0.05 mg·L-1)，中國規(guī)定，工業(yè)廢水中銅及其化合物最高容許排放濃度為1 mg·L-1，銅污染已經(jīng)引起了人們的廣泛關注。

海洋微藻是海洋的初級生產者，是維持海洋生態(tài)平衡的基礎。三角褐指藻 (Phaeodactylum triconutum)在分類上屬于硅藻門，羽紋綱，褐指藻目，褐指藻屬。分布范圍很廣，是海產經(jīng)濟動物的重要餌料，也是海洋浮游生物毒性測試中常用的實驗材料。Cu2+是藻類生長的必需元素，參與許多重要的生物反應如：光合作用和呼吸作用中的電子傳遞[2]，但是過量的Cu2+將產生較高的毒性[6]。銅的毒性效應歸因于活性氧自由基的產生而引起的氧化脅迫[7]。關于銅對藻類的毒性，前人已經(jīng)有過較多的研究，但是很大部分是關于銅對藻類的短期毒性[6,8,9]，研究的內容主要是藻類在Cu2+暴露低于96 h時對其生長和光合作用的影響以及酶活性等參數(shù)和這些生理參數(shù)對銅的敏感性，而對于藻類在Cu2+長期暴露下的研究則相對不多。本文探討了三角褐指藻經(jīng)過不同濃度的Cu2+長期暴露之后，對三角褐指藻生理特性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

三角褐指藻 (Phaeodactylum triconutum) 使用f / 2 培養(yǎng)基培養(yǎng)，溫度 (20 ± 0.5) ℃，光照 100 μmol·m-2·s-1，光暗周期比12∶12 h。選擇生長良好的指數(shù)生長期藻液。

1.2 方法

1.2.1 實驗處理 實驗所用培養(yǎng)液和器皿均經(jīng)高溫滅菌消毒，實驗使用 500 mL 三角瓶，實驗體積為300 mL，在GXZ智能型光照培養(yǎng)箱（寧波江南制造廠，中國）中20℃恒溫培養(yǎng)，光照強度為100 μmol·m-2·s-1，光周期L∶D為12∶12 h，每天搖瓶振蕩2 ～ 3次，并隨機調換三角瓶位置以減少因光照所造成的誤差。

通過之前的預實驗設計的Cu2+濃度分別為：0, 0.25 mg·L-1, 0.5 mg·L-1, 1.0 mg·L-1, 1.5 mg·L-15個梯度，用分析純的CuSO4配置成1.0 g·L-1的母液，用于配置成上述所需的濃度，每個梯度設3個重復。在上述的濃度下，三角褐指藻的接種密度為105cells·mL-1，經(jīng)過4 d的培養(yǎng)，將藻細胞密度稀釋到105cells·mL-1，再加入Cu2+母液到需要的濃度梯度。接種后每4 d為1輪，連續(xù)培養(yǎng)了4輪16 d，在第5輪，也即Cu2+長期暴露的17 ～ 20 d，對三角褐指藻的有關生理生化指標進行測定。

1.2.2 生長的測定 在第 5 輪開始，每天取一定量的藻液在顯微鏡下用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)，得到藻細胞密度，并用島津UV2450分光光度計測定藻樣在 680 nm 下的光吸收值，對計數(shù)結果進行驗證。

相對生長速率 (RGR) 通過以下公式計算：

式中：Nt為培養(yǎng)T小時的細胞密度（cells·mL-1）；N0為初始細胞密度（cells·mL-1）；T為培養(yǎng)時間（h）。

1.2.3 光合放氧與暗呼吸的測定 取Cu2+長期暴露20d的三角褐指藻藻液，用氧電極法（YSI Model 5300，美國) 測定三角褐指藻的光合放氧與暗呼吸速率。用循環(huán)水浴控制反應槽內的溫度為20℃。飽和光照強度（400 μmol·m-2·s-1），測定光合作用速率。通過用黑布遮蓋反應槽，測定黑暗條件下的藻類耗氧量從而得到暗呼吸速率。光合放氧與暗呼吸速率以單位毫克葉綠素每小時增加或消耗的毫摩爾氧氣數(shù)表示。

1.2.4 光化學效率的測定 在三角褐指藻經(jīng)過Cu2+長期暴露19 d之后，用便攜式熒光儀(PAM-Water-EDF, Walz, Effeltrich, Germany) 進行測定，測定其光系統(tǒng)II的有效光化學效率Yield (ΔF/Fm’) ：

式中：Ft’為光適應狀態(tài)下的初始熒光值，用0.3 μmol·m-2·s-1的調制光測定；Fm’為在光適應狀態(tài)下的最大熒光值，用0.8 s的5 600 μmol·m-2·s-1飽和光測定；ΔF為任意光適應狀態(tài)下的最大可變熒光值，ΔF=Fm’-Ft’。

1.2.5 光合色素的測定 在不同Cu2+濃度處理長期暴露了20 d混合均勻的藻液5 mL，過濾并轉移到試管中，加入5 mL無水甲醇并于4°C冰箱過夜提取葉綠素。提取液在2 000 g離心5 min后，取上清液于島津UV2450分光光度計掃描，得到其在400 ～ 750 nm波段的吸收光譜。葉綠素根據(jù)Porra (2002)[11]的計算公式式 (1) 計算，類胡蘿卜素根據(jù)Parsons和Stricklan (1963)[12]的計算公式式 (2) 計算。

式中：A750,A665,A652,A510,A480分別代表波長為750, 665, 652, 510 和480 nm 的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003, Origin7.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。用One-way ANOVA或者T-test鑒定差異的顯著水平 (P)，設顯著水平為P＜ 0.05, 極其顯著水平為P＜ 0.01。

圖 1 三角褐指藻在不同濃度Cu2+長期暴露后重新接種的4d后的細胞密度Fig.1 Cellular density after four days when Phaeodactylum triconutums were cultured renewedly after the long-term exposure of different concentrations of Cu2+

圖 2 三角褐指藻在不同濃度Cu2+長期暴露后重新接種的生長速率Fig.2 Relative growth rate when Phaeodactylum triconutums were cultured renewedly after the long-termexposure of different concentrations of Cu2+

2 結 果

2.1 生長

三角褐指藻經(jīng)過Cu2+長期適應后，第五輪重新接種的4 d后的細胞密度如圖1所示。由圖1可見，在各處理中，只有1.0 mg·L-1與對照組沒有顯著性差異（P＞ 0.05），其他處理與對照組相比均有顯著性差異（P＜ 0.05）。細胞密度隨著Cu2+濃度的變化趨勢為：先升高，而后隨著Cu2+濃度梯度的升高而下降。由圖2可知，在 0.25 ～ 1.5 mg·L-1處理中，相對生長速率隨著Cu2+濃度的升高而下降。所有Cu2+處理與對照組相比都有顯著性差異（P＜ 0.05），在高濃度（1.5 mg·L-1）處理組相對生長速率下降明顯，下降了大約12.6%，其他處理相對生長速率均比對照組要高。

由此可見，經(jīng)過Cu2+長期適應的三角褐指藻重新接種后在低濃度的Cu2+下，生長受到促進，而在高濃度下，生長才受到抑制。

2.2 葉綠素熒光特性

圖3 給出了不同Cu2+濃度長期暴露 (19 d) 對三角褐指藻有效光化學效率 (Yield) 和最大光化學效率(Fv/Fm) 的影響。如圖3所示：長期適應的三角褐指藻，重新接種，在不同濃度Cu2+處理72 h后的有效光化學效率 (Yield) 隨著Cu2+濃度的升高而顯著下降。長期適應的三角褐指藻光系統(tǒng)II (PSII) 的最大光化學效率Fv/Fm隨著Cu2+濃度的升高而下降，當Cu2+從0.25 mg.L-1升高到1.5 mg·L-1，與對照組相比，F(xiàn)v/Fm分別下降了6.99%，7.6%，11.5%，17.2%。

可見，三角褐指藻雖然經(jīng)過了Cu2+的長期適應，但是葉綠素熒光特性仍然明顯受到了影響，Cu2+使得三角褐指藻的光系統(tǒng)II (PSII) 反應活性下降。

圖 3 不同Cu2+濃度長期（19d）暴露對三角褐指藻有效光化學效率（Yield）和最大光化學效率（Fv/Fm）的影響Fig.3 Effect of the long-term（19d） exposure of different concentrations of Cu2+ on effective quantum efficiency (Yield) and the optimal quantum yield (Fv/Fm) of fluorescence parameters in Phaeodactylum triconutum

圖 4 不同Cu2＋濃度長期（20 d）暴露對三角褐指藻的光合放氧速率與呼吸作用的影響Fig.4 Effect of the long-term (20d) exposure of different concentrations of Cu2+on the rates of O2 evolution (photosynthesis) and O2 consumption (respiration) in Phaeodactylum triconutum

2.3 光合作用與呼吸作用

圖4 給出了不同Cu2＋濃度長期（20 d）暴露對三角褐指藻的光合放氧速率與呼吸作用的影響。如圖4所示，三角褐指藻在經(jīng)過長期的適應后重新接種，光合作用速率隨著Cu2+濃度的升高而下降，在所有的Cu2+處理組中，與對照組相比，光合放氧量都具有極其顯著的差異 (P＜ 0.01)。在0.25 mg·L-1到1.5 mg·L-1的處理中，與對照組相比，光合放氧速率分別下降了19%，22.5%，25.6%，26.5%。而對于暗呼吸作用，不同濃度Cu2+的處理中，都比對照組要低，除對照組外，呼吸作用速率隨著Cu2+的升高而升高。在低濃度0.25 mg·L-1與對照組相比，呼吸作用速率下降了達到了38.9%。

2.4 色素含量

圖5 給出了不同Cu2＋濃度長期暴露20 d對三角褐指藻葉綠素與類胡蘿卜素含量的影響。從圖5來看，三角褐指藻在不同Cu2+長期適應重新接種后，在所有Cu2+處理組中，葉綠素含量隨著Cu2+濃度的升高逐漸下降，對照組和低濃度（0.25 mg·L-1）組與高濃度 (1.5 mg·L-1) 組比較，均有顯著性差異 (P＜ 0.05)，1.5 mg·L-1濃度組與對照組和0.25 mg.L-1低濃度組相比，葉綠素含量分別下降了10.9%和10.2%，其他均無顯著性差異。而類胡蘿卜素的含量變化情況與葉綠素的情況不一致，所有經(jīng)過銅長期處理的三角褐指藻的類胡蘿卜素含量均比對照高，并且隨著Cu2+濃度的升高，類胡蘿卜素含量逐漸下降。

圖 5 不同Cu2＋濃度長期暴露（20d）對三角褐指藻葉綠素與類胡蘿卜素含量的影響Fig.5 Effect of the long-term（20d） exposure of different concentrations of Cu2+on contents of chlorophyll a and carotenoid in Phaeodactylum triconutum

3 討 論

3.1 對生長的影響

三角褐指藻經(jīng)過Cu2+長期暴露之后，重新接種培養(yǎng)時，細胞密度呈現(xiàn)出在低濃度 (0.25 mg·L-1，0.5 mg·L-1)下升高，在高濃度 (1.5 mg·L-1) 下降低（圖1）；有研究表明較低濃度（0.2 mg·L-1）的Cu2+對三角褐指藻的生長不僅沒有抑制作用，還促進了藻細胞的增殖，但是Cu2+濃度升高至0.317 mg·L-1時，藻細胞密度開始明顯低于對照組[13]。結果顯示在經(jīng)過銅長期暴露之后在1.0 mg·L-1以下時，藻細胞的生長均受到促進，因此可以看出三角褐指藻經(jīng)過Cu2+長期的適應之后，對Cu2+的敏感性顯著下降了，只有在更高的Cu2+濃度下生長才受到影響。在植物和藻類中，Cu2+對生長的影響歸因于引起了許多細胞學過程的故障[14]。三角褐指藻對銅的耐受性增加，可能是因多種因素，例如：表面反應或者與金屬復合物性質有關的胞外有機物質的產生[15-17]等，影響了測試溶液中的金屬化學性質，從而降低了Cu2+對三角褐指藻的毒性。

3.2 對葉綠素熒光特性的影響

體內葉綠素熒光與光合作用中的各種反應密切相關，包含了十分豐富的光合作用信息，對完整藻細胞葉綠素熒光的測定有助于了解光合作用過程中能量的吸收、分配和利用[18]?？梢酝ㄟ^對體內葉綠素熒光參數(shù)的測定反映多種逆境因子對植物光合作用的影響[19-20]， 因此葉綠素熒光被視為植物光合作用與環(huán)境關系的內在探針[21]。本實驗結果表明，三角褐指藻光化學效率 (Yield) 隨著Cu2+濃度的升高而顯著下降。從圖3推測Cu2+使得光系統(tǒng)II (PSII) 反應中心活性降低；原初電荷分離減少降低了光系統(tǒng)II的有效光化學量子產量 (Yield)。經(jīng)過Cu2+長期暴露的三角褐指藻PSII的最大光化學效率Fv/Fm隨著Cu2+濃度的升高而下降，各個Cu2+濃度處理與對照相比均有顯著性差異。Yield降低的原因可能是Cu2+的作用對象是PS II反應中心，Cu2+使得PS II原初光化學反應的電子供體受到抑制[22]；銅還可能使PS II供體和受體位點都遭到破壞，從而抑制光合作用中的電子傳遞[23]；另外Cu2+可以通過捕獲PS II反應中心的激發(fā)子使其產生類似光抑制的情形，Cu2+進入PS II反應中心的脫鎂葉綠素分子，使電子傳遞中斷[24]。因此，Yield，F(xiàn)v/Fm能夠靈敏地反應出Cu2+對PS II反應中心活性的降低以及抑制，Yield，F(xiàn)v/Fm可以作為三角褐指藻對Cu2+暴露的一個敏感性指標。

3.3 對光合作用和呼吸作用速率的影響

三角褐指藻經(jīng)過長期的適應后，重新接種培養(yǎng)，在第4 d的光合作用速率隨著Cu2+濃度的升高而下降（圖4），所有的Cu2+濃度處理組與對照組相比，光合放氧量都具有極其顯著性的差異 (P＜ 0.01)。結合圖1，在實驗條件下的Cu2+梯度，發(fā)現(xiàn)藻的生長和光合作用對Cu2+具有不同的敏感性，這種結果與在柵藻(Scenedesmus acutus) 中的發(fā)現(xiàn)是一致的，該研究發(fā)現(xiàn)藻的生長對Cu2+最為敏感，其次為光合作用和呼吸作用[25]。三角褐指藻在低Cu2+水平，光合作用與生長并不耦合[21]。在墨角藻 (Fucus serratus) 中光合作用和生長同樣也沒有相關性[8]。本研究認為Cu2+對生物量獲得的抑制效應與生長過程直接相關，而對光合作用的影響可能是次要因素，因此光合作用并不直接影響到生長速率。

三角褐指藻在經(jīng)過長期適應之后，呼吸作用速率高濃度的Cu2+處理組低于低濃度的Cu2+處理組，可能原因是高濃度的Cu2+處理中，呼吸作用的提高是為了更好地抵抗外界的脅迫，這與很多短期實驗產生的結果并不完全一致。Hugo Virgilio (2007) 發(fā)現(xiàn)，Scenedesmus incrassatulus在亞致死的Cu2+暴露下，呼吸作用在低濃度下升高，在高濃度下降低[9]；而Nalewajko和Olaveson (1995) 在柵藻 (Scenedesmus acutus) 中發(fā)現(xiàn)，低濃度的Cu2+對呼吸作用耗氧量呈現(xiàn)雙曲線函數(shù)關系[25]；水體中Cu2+含量的增加使光合作用受到抑制，而氧氣吸收的增加（更高的呼吸作用）是為了補償由此引起的必需能量的缺乏[26]。

3.4 對色素含量的影響

本實驗結果（圖5）表明，葉綠素含量隨著Cu2+濃度的升高而下降。關于Cu2+對藻類光合色素含量的負影響已經(jīng)有大量的報道[6]，葉綠素含量下降的原因：一是重金屬抑制葉綠素酸酯還原酶的合成；二是影響氨基酮戊酸的合成[27]。本研究認為可能是銅誘導了活性氧自由基產生，從而對色素和膜脂產生了過氧化損傷最終使得光合色素含量降低[28]。

類胡蘿卜素可以作為抗氧化劑清除活性氧，防止膜脂的過氧化，維持膜結構的穩(wěn)定[29]。本研究結果表明，三角褐指藻在經(jīng)過Cu2+的長期暴露之后，類胡蘿卜素含量與對照組相比都升高了，由此可以推測出，經(jīng)過長期的Cu2+的適應，三角褐指藻已經(jīng)產生了一系列的保護機制；但是在Cu2+的暴露中，從藻細胞的密度與光合放氧速率均可以看出，Cu2+仍然對三角褐指產生了毒害作用。

4 結 語

本研究可以得出如下結論：三角褐指藻經(jīng)過Cu2+長期暴露之后，三角褐指藻對銅的賴受性增加；葉綠素熒光參數(shù)對Cu2+相當?shù)拿舾校赡茏鳛槿呛种冈迨蹸u2+脅迫的靈敏指標；光合作用與生長并不耦合；類胡蘿卜素含量和呼吸作用速率升高可能能夠降低Cu2+對三角褐指藻的毒性。

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Physiological responses ofPhaeodactylum triconutumto long-term copper (Ⅱ) exposure

JIAN Jian-bo1, ZOU Ding-hui2, LIU Wen-hua1, ZHU Xi-feng1, LIU Hui-hui1

(1.Marine Biology Institute, Shantou University, Shantou 515063, China; 2.College of Environmental Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China)

This paper investigates the effect of the long-term exposure of different concentrations of copper (Ⅱ) on growth, photosynthesis, respiration and contents of pigments in the diatomPhaeodactylum triconutum.The results showed that the growth rates were stimulated under low concentration of Cu2+(0.25-0.5mg·L-1) , but were depressed under high concentration of Cu2+(1.5mg·L-1) .Both effective quantum efficiency (Yield) and the optimal quantum yield (Fv/Fm) were sensitive to Cu2+, being markedly reduced with the increase of Cu2+concentration.Photosynthetic rates were also inhibited with the exposure to Cu2+.However, the contents of carotenoid of the alga exposed to Cu2+were higher than the control, but the contents decreased while concentrations of Cu2+increased.It is proposed that chlorophyll fluorescence parameters can be a sensitive indication for Cu2+stress.Photosynthesis is not coupled with the growth.The increase of contents of carotenoids and the rates of respiration may protectPhaeodactylum triconutumfrom the toxicity of copper.

Phaeodactylum triconutum; chlorophyll fluorescence; photosynthesis; respiration; copper (Ⅱ)

X171.5

A

1001-6932 (2010) 01-0065-07

2008-12-30；

2009-05-25

國家863計劃資助項目 (2006AA10A416) 和廣東省科技計劃資助項目 (2006B20601005，2007A032600003)

簡建波（1984 –），男，江西新余人，在讀碩士研究生，主要從事海藻環(huán)境生物學的研究，電子郵箱：jbjian@126.com通訊作者：鄒定輝，電子郵箱：dhzou@scut.edu.cn