寧璇璇，紀(jì)靈，王剛，劉艷，于道德，宋培高，唐海田，伯云臺(tái)

（1.國(guó)家海洋局煙臺(tái)海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，山東 煙臺(tái) 264006；2.山東省海水養(yǎng)殖研究所，山東 青島 266071）

煙臺(tái)海域暴發(fā)滸苔ITS及5.8S rDNA的克隆及序列分析

寧璇璇1，紀(jì)靈1，王剛1，劉艷1，于道德2，宋培高1，唐海田1，伯云臺(tái)1

（1.國(guó)家海洋局煙臺(tái)海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，山東 煙臺(tái) 264006；2.山東省海水養(yǎng)殖研究所，山東 青島 266071）

以煙臺(tái)海域引發(fā)“綠潮”的滸苔為研究對(duì)象，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增出滸苔的ITS-1、5.8S rDNA及ITS-2片段，將擴(kuò)增出的片段純化后克隆至pGEM-T Easy載體，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果表明，滸苔的ITS-1序列長(zhǎng)度為195 bp，5.8S序列為155 bp，ITS-2序列為181 bp，該序列與滸苔屬的多種物種ITS序列具有很高的同源性，在ITS-1區(qū)、5.8S rDNA區(qū)和ITS-2區(qū)僅存在4個(gè)轉(zhuǎn)換/顛換位點(diǎn)。結(jié)合GenBank注冊(cè)序列和本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單純依靠ITS序列并不能對(duì)滸苔屬種類進(jìn)行有效的分類鑒定。

滸苔；內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (ITS)；5.8S rDNA；序列分析

滸苔Enteromorpha prolifera(Muell.) J.Ag.隸屬于綠藻門，綠藻綱，石莼目，滸苔屬，是中國(guó)海洋野生植物資源極為豐富的大型經(jīng)濟(jì)藻類，廣泛分布于中、低潮區(qū)的砂礫、巖石潮灘或石沼中[1]。

近年來(lái)，海洋污染的加劇造成了近海海域富營(yíng)養(yǎng)化日益嚴(yán)重，導(dǎo)致藻華發(fā)生的頻率增多、規(guī)模擴(kuò)大、危害程度加重。除了赤潮的頻繁暴發(fā)外，滸苔屬 (Enteromorpha)、石莼屬 (Ulva) 的多種綠藻也可在近岸海域形成“綠潮”（green tide）[2-5]。2007年夏季，青島海域出現(xiàn)了滸苔過(guò)度繁殖造成的“綠潮”，2008年入夏以來(lái)，黃海海域再次出現(xiàn)了嚴(yán)重的滸苔過(guò)度繁殖現(xiàn)象，煙臺(tái)海陽(yáng)海域也發(fā)生了滸苔“綠潮”現(xiàn)象。滸苔的過(guò)度繁殖將對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重的負(fù)面作用，不僅可造成海洋沉積物生物地球化學(xué)循環(huán)的解耦合[6]，而且能夠通過(guò)遮蔽陽(yáng)光影響海床生物的正常生長(zhǎng)[7]。

為探討滸苔過(guò)度增殖的機(jī)制，除了開展?jié)G苔來(lái)源及分布情況的相關(guān)調(diào)查外，還需要利用分子鑒定手段對(duì)滸苔來(lái)源及其動(dòng)態(tài)變化過(guò)程進(jìn)行快速分析。ITS (Internal Transcribed Spacer) 是核糖體DNA中18 S和28S rDNA之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，由于ITS序列在生物進(jìn)化過(guò)程中顯示種的特征，因而可以選擇其中保守程度不同的片段作為分子標(biāo)記來(lái)鑒定生物體不同種、亞種和地理株，以及研究其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系[8-10]。目前，在赤潮藻的分子鑒定方面，ITS序列已得到了較為廣泛的應(yīng)用[11-16]。

本研究以采自煙臺(tái)海陽(yáng)海域引發(fā)“綠潮”的滸苔為研究對(duì)象，通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得了滸苔的ITS和5.8S rDNA序列并進(jìn)行了相關(guān)分析，探討了其作為滸苔分子鑒定標(biāo)記的可能性和局限性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究中所用滸苔樣品采集自煙臺(tái)海陽(yáng)海域，樣品經(jīng)蒸餾水反復(fù)沖洗，洗凈后直接用于DNA提取。

1.2 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌Escherichia coliJM109感受態(tài)細(xì)胞、pGEM-T easy Vector購(gòu)自Promega公司。

1.3 主要試劑及儀器

氯仿、異戊醇、異丙醇購(gòu)自上海生物工程有限公司；β-巰基乙醇、CTAB、PVP等購(gòu)自Sigma公司；Ex-Taq酶、DL2000 DNA Marker購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；DNA片段凝膠回收試劑盒為Omega公司產(chǎn)品；其他常用試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

主要儀器包括：高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf，Eppendorf Centrfuge 5804R）、PCR儀（Biometra，T3 thermocycler）、電泳儀（北京君意，JY200系列）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，Quantity one system）等。

1.4 引物

根據(jù)綠藻綱18S和28S rDNA的保守序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物（F1: 5’-ACAAGGTTTCCGTAGGTGA-3’；R1: 5’-TTTAGTTTCTTATCCTCCG-3’），委托大連寶生物工程有限公司合成。

1.5 滸苔DNA提取

滸苔DNA的提取參照CTAB法[17,18]，并略做改動(dòng)，主要步驟如下：滸苔樣品經(jīng)液氮充分研磨后，加入適量裂解緩沖液（3% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，0.2% β-巰基乙醇，1% PVP），置于60℃溫浴30 min；向上述體系中加入1/3體積的5 mol/L KAc，充分混勻，加入等體積的氯仿-異戊醇（24:1），輕緩搖勻后，8 000 r/min離心10min；移取上清，加入2/3體積的異丙醇，-80℃放置30 min；8 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌兩次；沉淀晾干后用適量無(wú)菌水溶解，8 000 r/min離心10 min，取上清備用。

1.6 PCR擴(kuò)增

以提取的滸苔DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增出ITS及5.8S rDNA片段，擴(kuò)增體系為25 μL：含有50 ng DNA模板，2 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTP，0.2 μmol/L 引物，1.25單位Ex-Taq。PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。

1.7 擴(kuò)增片段的克隆及篩選

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用凝膠成像系統(tǒng)Quantity one system觀察并拍照記錄結(jié)果。以DNA片段凝膠回收試劑盒對(duì)所擴(kuò)增片段進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物連接到pGEM-T Easy載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞JMl09。采用藍(lán)白斑法挑選陽(yáng)性克隆，選取經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的5個(gè)克隆，送大連寶生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.8 序列分析

利用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/提供的在線軟件工具對(duì)獲得的序列進(jìn)行同源性分析[19]，表明所獲得的序列為ITS區(qū)域。采用Clustal W軟件[20]對(duì)所測(cè)得的滸苔ITS序列和GenBank中注冊(cè)的滸苔屬其它種類的ITS序列進(jìn)行多重對(duì)位排列 (Multiple alignments)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 滸苔ITS及5.8S rDNA序列的擴(kuò)增

海洋藻類通常具有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，而且多糖含量較高，提取的模板DNA用于PCR擴(kuò)增時(shí)往往效率不高。本研究采用改良的CTAB方法，輔以氯仿/異戊醇抽提，提取的滸苔DNA樣品具有良好的PCR擴(kuò)增效果。

以上述提取的滸苔DNA為模板，以F1和R1作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可見約650 bp的條帶（見圖1），與預(yù)期目的片段大小一致。

2.2 序列測(cè)定與分析

純化上述PCR產(chǎn)物，連接至pGEM-T easy載體，PCR篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果表明，該引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為643 bp，包含了部分18S和28S rDNA 序列。比對(duì)分析表明，煙臺(tái)海域引發(fā)“綠潮”的滸苔ITS-1序列為195 bp，5.8 S序列為155 bp，ITS-2序列為181 bp。該序列已經(jīng)提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，注冊(cè)號(hào)為FJ539192。

圖 l 煙臺(tái)海域滸苔ITS rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 The amplified product of ITS rDNA from Enteromorpha prolifera around the coast of Yantai by PCR technique

Blastn分析結(jié)果顯示，煙臺(tái)海域滸苔ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中滸苔屬的滸苔（GenBank注冊(cè)號(hào)：AB298314）、緣管滸苔Enteromorpha linza（GenBank注冊(cè)號(hào)：AJ000203）、Enteromorpha ahlneriana（GenBank注冊(cè)號(hào)：AJ012276）、Enteromorpha procera（GenBank注冊(cè)號(hào)：AY260558）ITS序列均具有高度同源性。多重比對(duì)結(jié)果表明，滸苔屬各物種的ITS序列非常保守，在ITS1區(qū)、5.8S rDNA區(qū)和ITS2區(qū)總共存在4個(gè)轉(zhuǎn)換/顛換位點(diǎn)（圖2）。

2.3 討論

ITS是介于核糖體18S和5.8S rDNA之間（ITS-1）以及5.8S和28S rDNA之間（ITS-2）的非編碼間隔區(qū)。由于ITS序列變異較快，可提供較豐富的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)，通常具有種內(nèi)相對(duì)一致、種間差異比較明顯的特點(diǎn)。這些特點(diǎn)使得ITS區(qū)適合于屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的種群間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分析，而且已被廣泛應(yīng)用于綠藻的分子鑒定[21-24]。結(jié)合GenBank注冊(cè)序列和本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單純依靠ITS序列并不能對(duì)滸苔屬種類進(jìn)行有效的分類鑒定。上述原因的產(chǎn)生可能是由于滸苔屬各物種的分化較晚，ITS區(qū)域尚未形成顯著的差異。因此，有必要采用其它的分子標(biāo)記技術(shù)，并結(jié)合滸苔屬各物種的形態(tài)特征、生活史等方面進(jìn)行分類鑒定。

圖 2 煙臺(tái)海域滸苔的ITS序列與滸苔屬其它物種的多序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Alignment of the ITS sequences of Enteromorpha prolifera from Yantai coast and four other species in the same genus

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Cloning and sequence analysis of the ITS and 5.8S rDNA ofEnteromorpha proliferaforming green tide around the coast of Yantai

NING Xuan-xuan1, JI Ling1, WANG Gang1, LIU Yan1, YU Dao-de2,
SONG Pei-gao1, TANG Hai-tian1, BO Yuntai1

(1.Yantai Oceanic Environmental Monitoring Central Station of State Oceanic Administration，Yantai 264006, China; 2. Mariculture Institute of Shandong Province, Qingdao 266071, China)

The internal transcribed spacer and 5.8S rDNA ofEnteromorpha proliferaforming green tide around the coast of Yantai were amplified by polymerase chain reaction (PCR) .The resultant PCR product was cloned into pGEM-T Easy vector and subjected to nucleotide sequencing.Sequence analysis revealed that the ITS-1, 5.8 S and ITS-2 rDNA of E.prolifera were of 195 bp, 155 bp and 181 bp in length, respectively.TheEnteromorpha proliferaITS sequence shared significant homology with other reported ITS sequences ofEnteromorphawith only one transition site and three transversion sites.These results suggested that analysis of ITS sequence could not effectively distinguish the species ofEnteromorpha.

Enteromorpha prolifera; internal transcribed spacer; 5.8S rDNA; sequence analysis

Q179.1; Q178.531

A

1001-6932 (2010) 01-0091-05

2008-12-30；

2009-06-17

寧璇璇（1983－），女，山東蓬萊人，助理工程師，碩士，主要從事海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)工作。電子郵箱：ningxx05@163.com通訊作者：于道德（1978－），男，山東青島人，博士。電子郵箱：wensentte@163.com