黃現(xiàn)青高曉平趙改名

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省肉制品加工與質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；3.雙匯集團(tuán)技術(shù)中心，河南 漯河 462003）

防腐劑復(fù)配優(yōu)化抗藤黃微球菌研究

黃現(xiàn)青1，2，3高曉平1，2趙改名1，2

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南省肉制品加工與質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；3.雙匯集團(tuán)技術(shù)中心，河南 漯河 462003）

選擇不同的防腐劑，通過藥敏紙片法、最小抑菌濃度（MIC）法測(cè)定藤黃微球菌對(duì)其敏感性，利用正交設(shè)計(jì)篩選最佳防腐劑組合，并對(duì)獲得的最佳防腐劑組合抑菌效果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，藤黃微球菌對(duì)Nisin、聚賴氨酸、尼泊金乙酯較為敏感，MIC分別為0.078，0.039，0.125mg/mL。當(dāng) Nisin、聚賴氨酸和尼泊金乙酯濃度分別為 0.313，0.156，0.125mg/mL時(shí)，組合抑菌效果最佳，可使基質(zhì)中藤黃微球菌降低2.7個(gè)數(shù)量級(jí)以上。選擇這一最佳組合在25℃和0～4℃條件下，可顯著抑制牛乳、里脊肉、獼猴桃果汁中藤黃微球菌的增殖。

防腐劑；藤黃微球菌；抑菌

藤黃微球菌廣泛分布于空氣、水、土壤中，是寄生于人體皮膚、咽部、眼睛等對(duì)人體無害的腐生菌，但機(jī)體抵抗力下降時(shí)，仍可引起各種感染，屬于條件致病菌［1］。近年來在抗生素選擇壓力下，條件致病菌日益增多，并且有繼續(xù)增高的趨勢(shì)［2］，因此對(duì)藤黃微球菌應(yīng)引起高度的重視［3］。此外，由于抗性的增強(qiáng)，相應(yīng)的也導(dǎo)致了其污染食品的機(jī)率，必須前瞻性的構(gòu)建食品中藤黃微球菌的控制技術(shù)。

乳酸鏈球菌素（Nisin）、聚賴氨酸、山梨酸鉀、乳酸鈉、尼泊金乙酯均是食品中常用的防腐劑，但是抑菌特點(diǎn)不同［4］，鮮見關(guān)于復(fù)配防腐劑抑制藤黃微球菌效果的研究。鑒于藤黃微球菌對(duì)食品安全的威脅，以及復(fù)配可降低單一防腐劑過量使用的風(fēng)險(xiǎn)，本試驗(yàn)用Nisin、聚賴氨酸、山梨酸鉀、乳酸鈉、尼泊金乙酯5種防腐劑來對(duì)藤黃微球菌的抑菌效果加以研究，并對(duì)防腐劑的最佳配比進(jìn)行優(yōu)化，旨在為商業(yè)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

Nisin、聚賴氨酸、山梨酸鉀、乳酸鈉、尼泊金乙酯：浙江銀象生物工程有限公司；

牛肉浸膏、蛋白胨：北京雙旋WSW培養(yǎng)基制品廠；

平板計(jì)數(shù)瓊脂：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

藤黃微球菌標(biāo)準(zhǔn)株：中科院微生物所。

1.1.2 主要儀器

酶標(biāo)儀：GF－M2000型，山東高密彩虹分析儀器有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：GTR10－1型，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；

超凈工作臺(tái)：JB－CJ－2FD型，蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DNP型，金壇市國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 LB液體培養(yǎng)基（牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、氯化鈉0.5%、pH 7.2～7.4）、LB固體培養(yǎng)基（在 LB液體培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂粉）、平板菌落計(jì)數(shù)瓊脂（稱取23.5g加入到1L蒸餾水中加熱煮沸溶解后分裝），均于121℃ 滅菌15min，冷卻后備用。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng) 取冰箱斜面保存藤黃微球菌活化后，接種到裝有100mL LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，接種3瓶，于37℃恒溫?fù)u床（120r/min）培養(yǎng)18h后，1瓶用于敏感性測(cè)定，另外2瓶在無菌條件下進(jìn)行以下操作：3 000r/min離心15min收獲菌體；然后用50mL無菌生理鹽水懸浮，3 000r/min離心15min，收獲菌體；無菌生理鹽水漂洗重復(fù)3次后，再用無菌生理鹽水漂洗懸浮菌體，使細(xì)菌細(xì)胞濃度在105CFU/mL左右，備用。

1.2.3 敏感性測(cè)定 敏感性測(cè)定分別采用藥敏紙片法和最小抑菌濃度法（MIC），參照文獻(xiàn)［5］進(jìn)行。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取3種敏感性較高的防腐劑為試驗(yàn)因子，以MIC值和食品最大添加量為參考選擇3水平，設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)。具體操作步驟為：首先按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)將復(fù)合防腐劑配制好，各取1mL分別裝入無菌試管中；然后各加入1.2.2制備的無菌生理鹽水懸浮菌液1mL，同時(shí)設(shè)立不添加防腐劑的空白對(duì)照，均于25℃條件下處理6h后，通過菌落平板計(jì)數(shù)法測(cè)定殘留存活藤黃微球菌細(xì)菌數(shù)量，評(píng)價(jià)防腐劑的抑菌效果，篩選最優(yōu)防腐劑復(fù)配組合。

1.2.5 應(yīng)用試驗(yàn) 以肉、乳、果汁為基質(zhì)，每100g各加入1.2.2培養(yǎng)后的藤黃微球菌1mL，然后加入經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化后的復(fù)配防腐劑1mL。把樣品分別于25℃、0～4℃放置不同時(shí)間后，通過平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定殘留存活細(xì)菌總數(shù)，研究其在不同食品介質(zhì)中的防腐效果。

1.3 菌落計(jì)數(shù)

菌落總數(shù)的測(cè)定按照 GB/T 4789.2——2010，采用平板傾注法［6］。

2 結(jié)果與分析

2.1 敏感性測(cè)定結(jié)果

利用藥敏紙片法測(cè)定不同防腐劑對(duì)藤黃微球菌抑菌圈的大小，確定藤黃微球菌對(duì)不同防腐劑的敏感性，試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 抑菌圈直徑ńTable 1 Inhibition zone diameter /mm

由表1可知，Nisin、聚賴氨酸、尼泊金乙酯對(duì)藤黃微球菌有抑菌作用，在濃度為20mg/mL時(shí)抑菌圈直徑分別是11，10.5，7mm。

以96孔微量酶標(biāo)板測(cè)定 MIC，利用GF－M2000酶標(biāo)儀在492nm處測(cè)定吸光度值。結(jié)果表明，Nisin、聚賴氨酸、尼泊金乙酯的 MIC分別為0.078，0.039，0.25mg/mL。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

參照各種防腐劑在食品中的應(yīng)用限量以及其MIC值，考慮協(xié)同作用及減少防腐劑在食品中的添加量，設(shè)計(jì)防腐劑的水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（見表2）。表2中A/B兩個(gè)因子的水平是參照MIC值，在考慮了其食品添加限量的基礎(chǔ)上，以4倍比的梯度設(shè)立的，旨在能獲得最佳的抑菌效果。正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見表3。由表3可知，3種防腐劑抑菌性由強(qiáng)至弱依次為Nisin＞聚賴氨酸＞尼泊金乙酯，最優(yōu)組合為Nisin 0.313mg/mL、聚賴氨酸0.156mg/mL、尼泊金乙酯0.125mg/mL。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（見表4）證明在此最優(yōu)組合條件下，可顯著的抑制或殺滅藤黃微球菌。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 Orthogonal factors and the level/（mg·mL－1）

2.3 應(yīng)用試驗(yàn)

室溫（25℃）及0～4℃處理3種樣品菌落計(jì)數(shù)結(jié)果見表5。由表5可知，3種樣品加入最佳復(fù)配防腐劑后，在室溫條件下可有效地減緩細(xì)菌的增殖。獼猴桃汁、里脊肉、牛乳中細(xì)菌數(shù)在經(jīng)過4d放置后，僅僅分別增長(zhǎng)3.14、2.85、0.67個(gè)數(shù)量級(jí)，顯著的低于沒有添加防腐劑的對(duì)照組。同樣的在0～4℃ 條件下，復(fù)配防腐劑抑菌效果更加明顯，獼猴桃汁、里脊肉和牛乳在放置5d后分別降低了1.3、0.6、1.3個(gè)數(shù)量級(jí)，而沒有添加防腐劑的對(duì)照組細(xì)菌數(shù)均有明顯的增加。3種樣品的腐敗速度以牛乳最快，而獼猴桃最慢，可能與獼猴桃中含有豐富的VC、果酸等成分，具有防腐效果有關(guān)［7］。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 3 Orthogonal test results

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)Table 4 Test validate

通過表5還可以看出，復(fù)配防腐劑在低溫條件下抑菌效果較好。這是因?yàn)樵谑覝貤l件下，細(xì)菌增殖較快，同時(shí)由于食品介質(zhì)的影響，防腐劑抑菌效果會(huì)有所減弱。而在低溫條件下，細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖基本停止，復(fù)配防腐劑可表現(xiàn)出較好的抑菌效果，甚至具有一定的殺菌效果。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明Nisin、聚賴氨酸和尼泊金乙酯對(duì)藤黃微球菌具有明顯的抑菌效果。當(dāng)其濃度為20mg/mL時(shí)，抑菌圈直徑分別為11，10.5，7mm；利用96微孔板法測(cè)得其 MIC分別為0.078，0.039，0.125mg/mL；通過正交試驗(yàn)獲得其最佳復(fù)配比例為：乳酸鏈球菌0.313mg/mL、聚賴氨酸0.156mg/mL和尼泊金乙酯0.125mg/mL，在此復(fù)配比例下，可使基質(zhì)中藤黃微球菌降低2.7個(gè)數(shù)量級(jí)以上。

表5 食品介質(zhì)應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果ńTable 5 Application test results of different food medium /（CFU·mL－1）

通過在不同食品介質(zhì)中驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，表明在25℃貯藏時(shí)可以有效抑制細(xì)菌的增殖，可保障獼猴桃汁、里脊肉、牛乳在經(jīng)過4d放置后，細(xì)菌總數(shù)僅僅分別增長(zhǎng)3.14、2.85、0.67個(gè)數(shù)量級(jí)。而在0～4℃放置時(shí)3種樣品中細(xì)菌總數(shù)都顯著減少，貯藏5d后分別降低了1.3、0.6、1.3個(gè)數(shù)量級(jí)。通過系統(tǒng)研究，獲得了有效的防腐劑復(fù)配組合，為其在食品中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

復(fù)配可降低單一防腐劑的用量，也是本試驗(yàn)的主要目的之一。單一防腐劑的MIC卻明顯低于復(fù)配中劑量的原因?yàn)椋河捎跍y(cè)定MIC使用的是LB液體培養(yǎng)基，對(duì)防腐劑抑菌效果影響極小，而在食品介質(zhì)中成分較為復(fù)雜，微生物種類較多，對(duì)防腐劑的抑菌效果影響較大，所以優(yōu)化試驗(yàn)以MIC值為基數(shù)，按照倍比的方法設(shè)計(jì)的試驗(yàn)梯度（同時(shí)也考慮到了各種防腐劑在食品中的添加限量）。雖然看復(fù)配防腐劑濃度比MIC值高出很多，但是還是比食品中防腐劑添加劑量有較大的降低。

1 宗淑杰，吳明江，秦銀河，等.醫(yī)家金鑒·檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)卷（下）［M］.北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2007：300.

2 曾鋒，張立彥，曾慶孝.微生物對(duì)食品防腐劑的抗藥性研究進(jìn)展［J］.食品與機(jī)械，2005，21（2）：51～53.

3 姜梅杰，魏緒廷.顱腦外傷患者腦脊液中檢出藤黃微球菌一例［J］.中華神經(jīng)外科雜志，2005，21（12）：735.

4 張鷹，曾新安，溫其標(biāo).生物防腐劑及其在食品中的應(yīng)用［J］.食品與機(jī)械，2006，22（1）：77～79.

5 黃現(xiàn)青，別小妹，呂鳳霞，等.枯草芽孢桿菌fmbJ產(chǎn)脂肽抑制點(diǎn)青霉效果及其桃防腐試驗(yàn)［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2008，24（1）：263～267.

6 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB/T4789.2——2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

7 徐幸蓮，彭增起，鄧桑貴.食品原料學(xué)［M］.北京：中國(guó)計(jì)量出版社，2006：116～120.

Study on sterilization of optimization of preservative combination againstmicrococcus luteus

HUANG Xian－Qing1，2，3GAO Xiao－Ping1，2ZHAO Gai－Ming1，2

（1.College of Food Science and Technology，Henan Agricultural University，Zhengzhou，Henan450002，China；2.Henan Key Laboratory of Meat Processing and Quality Safety Control，Zhengzhou，Henan450002，China；3.Technology Center of Shineway Group，Luohe，Henan462003，China）

The inhibitive effect onmicrococcus luteusthrough the determination of the sensitivity，minimum inhibitory concentration （MIC），orthogonal experimental optimization and application effect experiment with different preservative were studied in the paper.The results showed thatmicrococcus luteusare are sensitive to nisin，ε－polylysine and ethylparaben with MIC 0.078mg/mL，0.039mg/mL，0.125mg/mL respectively.The sterilization effect onmicrococcus luteuswas best when concentrations of the nisin，ε－polylysine and ethylparaben were 0.313mg/mL，0.156mg/mL，0.125mg/mL respectively，the bactericidal effect was best combination conditions，and depress 2.7orders ofmicrococcus luteusin food medium.That could significantly inhibitmicrococcus luteusmultiplication in the milk，meat，syrup of Chinese goosebeery when select the best preservative combination at 25℃and at 0～4℃.

preservative；micrococcus luteus；inhibition

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.06.001

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（編號(hào)：200903012）；河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：082300430050）

黃現(xiàn)青（1977－），男，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)副教授，博士。E－mial：hxq8210＠126.com

趙改名

2010－06－01