林鵬飛，郝元斌，郭慧利，劉紅林，芮 榮

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

豬分離卵泡體外培養(yǎng)過程中Fas/FasL對顆粒細胞凋亡的作用

林鵬飛，郝元斌，郭慧利，劉紅林，芮 榮*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

從豬卵巢分離完整有腔卵泡，按質(zhì)量分為3類：健康卵泡、早期閉鎖卵泡和晚期閉鎖卵泡。豬分離卵泡經(jīng)眼觀檢查后再行石蠟切片和HE染色，形態(tài)學(xué)研究表明，眼觀檢查對于健康卵泡的判定準確率為92%。取健康卵泡按直徑大小分為3組：直徑＞5 mm大卵泡組、3～5 mm中卵泡組和＜3 mm小卵泡組。卵泡培養(yǎng)8、16和24 h，以Annexin-V FITC/PI雙染流式細胞儀檢測壁層顆粒細胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)卵泡顆粒細胞的總凋亡率（早期凋亡＋晚期凋亡）在8 h時就已達到70%以上，至24 h則為81.1%～94.6%。收集無血清培養(yǎng)0、8、16、24、48和72 h的卵泡顆粒細胞，用real time PCR SYBRgreen法檢測各組卵泡顆粒細胞FasL和Fas mRNA相對表達量。各級卵泡顆粒細胞中FasL mRNA水平隨培養(yǎng)時間顯著增加，培養(yǎng)至24 h達最大值（P＜0.05）；小卵泡顆粒細胞FasL mRNA水平均高于大、中卵泡組。各級卵泡顆粒細胞Fas mRNA相對表達量在培養(yǎng)前（0 h）差異不顯著，8 h時顯著增加，48 h達最大值。該實驗表明，所用無血清卵泡培養(yǎng)體系可有效誘導(dǎo)卵泡顆粒細胞的凋亡，細胞凋亡是卵泡閉鎖的主要誘因，但卵泡閉鎖程度可因卵泡大小而異，小卵泡似乎更容易發(fā)生閉鎖。

豬；有腔卵泡；顆粒細胞；凋亡；Fas/FasL

哺乳動物卵巢上存在大量的各級卵泡，卵泡生長過程中僅有少數(shù)能夠發(fā)育至成熟排卵，絕大部分歸于閉鎖。研究表明，顆粒細胞凋亡是導(dǎo)致卵泡閉鎖的重要原因(Matsuda-minehata et al, 2006)。豬卵泡顆粒細胞凋亡至少與5種配體受體系統(tǒng)有關(guān)：腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha, TNFα）和TNF受體系統(tǒng)；腫瘤壞死基因相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）和TRAIL受體系統(tǒng)；Fas配體受體系統(tǒng)；APO-3配體受體系統(tǒng)及PFG-5配體受體系統(tǒng)(Manabe et al, 2004)。TNFα的不同作用是通過特殊的細胞表面受體TNFR-1或TNFR-2來實現(xiàn)的，TNFR-1-TRADD-FADD-caspase-8信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能引起細胞凋亡，而TNFR-1-TRADD-RIP-TRAF-2信號傳導(dǎo)通路則為存活因子。在卵泡閉鎖早期，顆粒細胞層出現(xiàn)TNFR-2強烈免疫染色，表明在豬卵泡閉鎖過程中TNFα是作為存活因子而起作用（Nakayama et al, 2003）。在TRAIL和TRAIL受體系統(tǒng)中，已發(fā)現(xiàn)的受體包括DR-4、DR-5和DcR-1。DcR-1只表達于豬健康卵泡顆粒細胞中，而TRAIL、DR-4和DR-5在閉鎖卵泡顆粒細胞中高表達，說明TRAIL及其受體DR-4和DR-5與豬卵泡閉鎖過程中顆粒細胞凋亡的誘導(dǎo)有關(guān)，DcR-1在顆粒細胞凋亡過程中起抑制作用(Inoue et al, 2003)。FasL與Fas是研究較多、也是最主要的一對死亡配體-受體，F(xiàn)as也稱Apo-l或CD95，是腫瘤壞死因子和神經(jīng)生長因子受體(TNF/NGF-R)家族的細胞表面分子，它是FasL的受體；FasL是腫瘤壞死因子(TNF)家族的細胞表面分子。Fas和FasL在人類、大鼠、小鼠、牛、雞及豬的卵巢上都有表達(Quirk et al, 1995; Chen et al, 2005; Dharma et al, 2003; Porter et al, 2000; Bridgham & Johnson, 2001; Inoue et al, 2006)，但mRNA和蛋白表達存在種屬特異性(Nakayama et al, 2000)，因此作用機理在不同種類動物間也有差異。當缺少必要的存活因子或存在凋亡因子時，F(xiàn)asL與Fas結(jié)合，導(dǎo)致Fas胞內(nèi)的死亡域形成三聚體而活化，并引起與之結(jié)合FADD構(gòu)象改變，使caspase-8前體開始自動解蛋白的分裂和激活，產(chǎn)生有活性的caspase-8，從而激發(fā)一系列下游的caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)細胞凋亡(Matsuda-minehata et al, 2006)。

現(xiàn)有的對于Fas/FasL的研究多集中于各種動物腔前卵泡，而在有腔卵泡體外培養(yǎng)過程中顆粒細胞凋亡的研究迄今鮮見報道。本實驗擬通過對豬卵巢完整卵泡的分離培養(yǎng)，測定并分析豬不同發(fā)育階段有腔卵泡在不同培養(yǎng)時間的顆粒細胞凋亡率及Fas和FasL mRNA的表達量變化，以期了解Fas/FasL在豬有腔卵泡閉鎖中的作用，為進一步了解豬有腔卵泡閉鎖的機理提供實驗資料。

1 材料與方法

實驗所用各項試劑除特別說明者以外，均為SIGMA產(chǎn)品。

1.1 卵巢來源

豬卵巢采自南京市哈慈天環(huán)食品有限公司下屬屠宰場，卵巢置于37℃無菌生理鹽水（含青霉素、鏈霉素各500 IU/mL）中，2 h內(nèi)送達實驗室。

1.2 完整有腔卵泡的分離及分組

在無菌條件下，先用杜氏磷酸鹽緩沖液（Dulbecco’s phosphate buffered saline, PBS）洗卵巢2～3次，放入含適量PBS平皿中，先用眼科剪剪去卵巢周圍多余組織及系膜，再沿系膜緣將卵巢剪開，眼科鑷細心剝離有腔卵泡，盡量去除其周圍結(jié)締組織，再細心剝離完整卵泡，置于PBS中。在實體顯微鏡下肉眼觀察卵泡形態(tài)，按質(zhì)量將所分離卵泡分為3類：（1）健康卵泡。卵泡壁結(jié)構(gòu)完整、均勻、緊密，略呈粉紅色或黃色，毛細血管分布均勻、色澤鮮紅，卵泡液清亮，一般可見到卵丘。（2）早期閉鎖卵泡。卵泡壁結(jié)構(gòu)較均勻，但內(nèi)層稍呈絮狀化，或壁上有少量暗色斑塊，卵泡略呈灰白色，血管較少或血管較粗大、顏色變淡，卵泡液稍混濁，少數(shù)可見到卵丘，（3）晚期閉鎖卵泡。卵泡壁結(jié)構(gòu)不均勻，顏色灰暗，毛細血管較少，內(nèi)部絮狀化嚴重或可見到卵泡內(nèi)部有暗色的團快；卵丘一般不可見(Alonso-Pozos et al, 2003; Jolly et al, 1997)。取健康卵泡用于Fas和FasL mRNA檢測，按直徑大小又將其分為3組：大卵泡組卵泡直徑＞5 mm、中卵泡組直徑為3～5 mm、小卵泡組直徑＜3 mm。

1.3 卵泡切片制作與HE染色

采用改進的切片制作方法分別處理3組卵泡，用Bouin氏固定液(苦味酸飽和水溶液75 mL、40%甲醛25 mL、冰醋酸5 mL)固定72 h；水洗、濾紙吸干后進行梯度酒精脫水（依次為30%、50%酒精各1 h，70%酒精24 h，80%、2次95%各2 h，2次無水酒精各1 h）；然后轉(zhuǎn)入二甲苯:無水酒精（v/v為1∶1）混合液中1h，二甲苯Ⅰ液、Ⅱ液各30 min（Ⅰ液、Ⅱ液均為100%二甲苯），至組織透明為止。經(jīng)透明處理樣本依次放入預(yù)先融化的石蠟:二甲苯（v/v為1∶1）中浸30 min，石蠟Ⅰ浸1 h，石蠟Ⅱ浸1 h；冷卻后的蠟塊經(jīng)修整后采用常規(guī)方法切片；常規(guī)HE染色，封片后在光鏡下觀察。

1.4 完整卵泡的培養(yǎng)

大、中、小3組健康卵泡先用PBS洗2次、卵泡培養(yǎng)液洗1次。卵泡培養(yǎng)液為無血清TCM199（GIBCO產(chǎn)品）培養(yǎng)液，用24孔板進行培養(yǎng)，每孔加1.5 mL培養(yǎng)液并放入1個卵泡，培養(yǎng)條件為38.5℃、5%CO2氣相和飽和濕度。分別于培養(yǎng)0（對照）、8、16、24、48和72 h，用眼科鑷輕輕撕破卵泡，去除卵母細胞?卵丘復(fù)合體，擠壓并翻開卵泡膜輕刮卵泡壁層顆粒細胞，直接用吸管吸取全部卵泡液和顆粒細胞，置于離心管內(nèi)以2 000 r/min離心5 min，收集顆粒細胞直接凍存于?70℃用作凋亡分析。

1.5 Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測

經(jīng)上述方法培養(yǎng)8、16和24 h的大、中、小卵泡，所獲新鮮顆粒細胞按BIPEC Bioreagent凋亡試劑盒產(chǎn)品說明書所述步驟操作，細胞立即用4℃冰箱預(yù)冷的PBS液離心洗滌2次，去除PBS；再用PBS調(diào)整細胞密度至1×106細胞/mL，1 mL細胞中加入400 μL Binding Buffer懸浮細胞；加入5 μL Annexin V-FITC（膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素），蝸旋混勻，置于4℃條件下避光反應(yīng)15 min；添加10 μL PI（碘化丙啶），于4℃條件下避光反應(yīng)5 min，1 h內(nèi)進行流式細胞儀（BD FACSCanto）分析。每份樣品檢測10 000個細胞，所獲數(shù)據(jù)經(jīng)BD FACSDiva?software軟件處理后，換算為細胞凋亡比例。在二維FCM分析圖上，細胞分為4個亞群：左下象限為AnnexinV-FITC-/ PI-活細胞群，右下象限為AnnexinV-FITC+/PI-早期凋亡細胞；右上象限顯示AnnexinV-FITC+/PI+細胞為晚期凋亡與壞死細胞，左上象限為AnnexinV-FITC-/ PI+操作過程中發(fā)生機械損傷的細胞。

1.6 樣品總RNA制備與反轉(zhuǎn)錄

按Trizol（Invitrogen產(chǎn)品）試劑盒提供的說明書略加改進后，進行顆粒細胞總RNA抽提；生物分光光度計（BioPhotometer 6131）測OD值及總RNA濃度，1.2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合凝膠成像（Tanon GIS2500）檢測RNA完整性。各取檢測合格的上述RNA樣品0.5 μg，用ReverTra Ace?qPCR RT Kit（TOYOBO公司）在TaKaRa PCR擴增儀上合成cDNA第一鏈，?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 引物設(shè)計與real time PCR反應(yīng)

根據(jù)目的基因庫中mRNA序列和real time PCR對引物的要求，利用軟件Oligo 6設(shè)計β-actin、Fas和FasL的特異性引物，引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成（表1）。 應(yīng)用real time PCR Master Mix Kit（TOYOBO公司）及MJ Opticon熒光定量PCR儀進行擴增。 反應(yīng)體系包含SYBRgreen MIX 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，cDNA模板2 μL，加Nuclease-free Water補足體積至20 μL。反應(yīng)程序為：95℃ 30 s預(yù)變性，再在94℃ 5 s變性，β-actin（57℃）、FasL（58℃）、Fas（59℃）10 s退火，72℃15 s延伸，循環(huán)45次，反應(yīng)結(jié)束后執(zhí)行熔解曲線，確定反應(yīng)產(chǎn)物的單一性。在定量PCR儀上記錄每個樣本的Ct值，結(jié)果分析采用相對定量法，以2-△△Ct獲得的數(shù)值來比較在不同的處理之下，相對于內(nèi)參β-actin各基因的mRNA的表達量(Livak & Schmittgen, 2001)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個樣本設(shè)置3次重復(fù)，每次實驗均設(shè)立1個空白對照。所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差（±s）表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件One-Way ANOVA LSD法進行差異顯著性檢驗，P＜0.05判為差異顯著。

表 1 Real time PCR引物序列Tab. 1 The primers sequence for the real time PCR

2 結(jié) 果

2.1 豬卵巢卵泡的分離與質(zhì)量判定

在顯微鏡下可直接觀察評價卵泡質(zhì)量，但判定結(jié)果的準確性則往往與實驗人員的經(jīng)驗有關(guān)。為驗證本實驗對豬分離卵泡直觀形態(tài)學(xué)判斷的準確性，按質(zhì)量所分的3組卵泡經(jīng)石蠟切片和HE染色后于鏡下觀察。各階段卵泡形態(tài)學(xué)特征如下：(1) 健康卵泡的卵泡壁結(jié)構(gòu)完整、均勻、緊密，略呈粉紅色或少數(shù)見黃色，毛細血管分布均勻、色澤鮮紅，卵泡液清亮，一般可見到卵丘。HE染色后，健康卵泡壁各層完整、層次清晰，顆粒細胞體積較大，細胞漿及細胞核染色均勻，核位于細胞中央，顆粒細胞層中僅有少量凋亡細胞，卵泡腔中無脫落的顆粒細胞。（2）早期閉鎖卵泡在低倍鏡下膜細胞與壁層顆粒細胞之間界限較清楚，卵泡壁外層完整，基膜部分退化，與顆粒層有不同程度的分離，顆粒層細胞彼此結(jié)合松散，有少量顆粒細胞脫落到卵泡腔中；高倍鏡下顆粒細胞核膜皺縮，出現(xiàn)染色質(zhì)凝縮，向核邊緣聚集，部分可見凋亡細胞常見的典型的半月結(jié)構(gòu)，胞質(zhì)中出現(xiàn)少量的空泡。（3）晚期閉鎖卵泡壁外層完整，基膜退化，與顆粒層有不同程度的分離，顆粒層細胞彼此結(jié)合變松散，顆粒細胞部分或全部脫落于卵泡腔中，顆粒細胞的細胞核呈深染，或碎裂為閉鎖小體（圖1）。形態(tài)學(xué)研究表明，眼觀檢查卵泡并分類的準確率在76%～92%之間（表2），對于健康卵泡的判定準確率達92%。依據(jù)這一結(jié)果，通過眼觀檢查選擇健康卵泡用于后面的實驗。

圖 1 豬分離卵泡的眼觀形態(tài)與組織學(xué)特征Fig. 1 Morphological observation and histological feature of porcine isolated follicles

表 2 豬不同質(zhì)量卵泡眼觀檢查與組織學(xué)檢查準確性的比較Tab.2 Comparison of the acuracy of classification by morphometric criteria with HE staining

2.2 體外培養(yǎng)卵泡的形態(tài)學(xué)變化

大、中、小3組健康的豬分離卵泡培養(yǎng)16 h后，各組卵泡均表現(xiàn)出卵泡壁結(jié)構(gòu)完整、緊湊、無脫落細胞，血管逐漸變得不明顯，各組卵母細胞都包被3層以上卵丘/顆粒細胞；中、小卵泡組卵泡液輕微渾濁，整個卵泡變得不透明。培養(yǎng)24 h的各組卵泡結(jié)構(gòu)完整，但卵泡表面開始有細胞脫落，卵泡液渾濁。培養(yǎng)48 h后，大、中卵泡組常見卵泡塌陷、松弛；小卵泡的卵泡壁開始溶解，卵泡外脫落細胞增多并向周圍擴散，卵泡液中顆粒細胞散在分布，整個卵泡外觀發(fā)白，卵母細胞只包被1、2層卵丘細胞，且卵丘細胞排列疏松。卵泡壁溶解嚴重的小卵泡，其卵母細胞往往變成裸卵且開始退化。在整個培養(yǎng)過程中，卵泡體積未發(fā)生明顯變化，僅前24 h略有縮小，可能是新鮮有腔卵泡的內(nèi)壓較大，培養(yǎng)初期卵泡液滲透到卵泡外所致。

2.3 培養(yǎng)卵泡顆粒細胞凋亡率的變化

分離卵泡培養(yǎng)8、16、24 h分別取顆粒細胞作凋亡檢測，結(jié)果列如表3，部分測定的散點圖見圖2。

表 3 豬體外培養(yǎng)卵泡的顆粒細胞Annexin V-FITC/PI雙染檢測結(jié)果Tab. 3 Results of Annexin V-FITC/PI double-labeling examination for granulosa cells derived from porcine antral follicles cultured in vitro

圖 2 部分顆粒細胞Annexin V-FITC/PI雙染檢測散點圖Fig. 2 Partial scatterplots of granulosa cells examined by Annexin V-FITC/PI double-labeling

由表3可見，大、中、小卵泡培養(yǎng)8 h后，顆粒細胞均已出現(xiàn)大量凋亡，雖然大卵泡中活細胞比率顯著高于中、小卵泡組（P＜0.05），但也僅有28.4%。大卵泡培養(yǎng)早期的顆粒細胞凋亡率明顯低于中、小卵泡組（P＜0.05），晚期凋亡與壞死細胞比率顯著增加（P＜0.05）。中、小卵泡組的活細胞和晚期凋亡/壞死細胞差異不顯著。小卵泡中大量顆粒細胞處于早期凋亡狀態(tài)，顯著高于其他各組。培養(yǎng)至16 h和24 h時，大卵泡組活細胞比率進一步減少，早期凋亡細胞數(shù)隨之增加，而晚期凋亡與壞死細胞數(shù)變化不明顯；中卵泡組培養(yǎng)后的活細胞比率變化不大，但早期凋亡細胞明顯轉(zhuǎn)為晚期凋亡與壞死細胞（P＜0.05）。小卵泡組培養(yǎng)16 h活細胞數(shù)似乎略有增加，但無統(tǒng)計學(xué)差異；培養(yǎng)24 h時則顯著下降（P＜0.05），大量早期凋亡細胞轉(zhuǎn)為晚期凋亡與壞死細胞（P＜0.05）。本實驗表明，所用無血清卵泡培養(yǎng)體系可有效誘導(dǎo)卵泡顆粒細胞的凋亡；在此培養(yǎng)過程中，小卵泡最易發(fā)生閉鎖，而大卵泡明顯較中、小卵泡組表現(xiàn)出高的抗凋亡能力。

2.4 卵泡培養(yǎng)過程中顆粒細胞FasL mRNA相對表達量的檢測

收集培養(yǎng)0、8、16、24、48和72 h的卵泡顆粒細胞，用real time PCR SYBRgreen法檢測各組卵泡顆粒細胞FasL mRNA相對表達量如圖3。大、中、小卵泡顆粒細胞FasL mRNA的表達，隨培養(yǎng)時間發(fā)生的整體變化趨勢大致相似。顆粒細胞中FasL mRNA水平隨培養(yǎng)時間顯著增加，健康卵泡（0 h）的FasL mRNA水平在大、中、小卵泡無差異，培養(yǎng)至24 h均顯著增高（P＜0.05）。在培養(yǎng)過程中的每個時間點，小卵泡顆粒細胞FasL mRNA水平均高于大、中卵泡組，以培養(yǎng)16 h 時的增加最為顯著（P＜0.05），培養(yǎng)至24 h達最大值。

2.5 卵泡培養(yǎng)過程中顆粒細胞Fas mRNA的表達

培養(yǎng)前（0 h）的各級卵泡顆粒細胞Fas mRNA相對表達量差異不顯著，培養(yǎng)至8 h均顯著增加，48 h達最大值，72 h的Fas mRNA相對表達量雖較48 h的表達量稍有下降，但仍顯著高于0 h（圖4）。培養(yǎng)0～72 h的每個時間點內(nèi)，大、中、小卵泡顆粒細胞的Fas mRNA相對表達量差異不顯著。

圖 3 豬大、中、小有腔卵泡培養(yǎng)不同時間后顆粒細胞FasL mRNA的表達Fig. 3 Expression of FasL mRNA in porcine granulosa cells derived from different size of antral follicles cultured in vitro

圖 4 豬大、中、小卵泡培養(yǎng)不同時間后顆粒細胞Fas mRNA的表達Fig. 4 Expression of Fas mRNA in porcine granulosa cells derived from different size of follicles cultured in vitro

3 討 論

無血清培養(yǎng)可誘導(dǎo)顆粒細胞和其它類型細胞發(fā)生凋亡(Parborell et al, 2005; Guthrie et al, 1998)，是用于研究生殖激素、生長/細胞因子等作用凋亡通路的理想模型，它可有效避免血清培養(yǎng)時未知因素的干擾。本實驗結(jié)果顯示，各級有腔卵泡中壁層顆粒細胞的凋亡率在培養(yǎng)8 h即可大幅上升，培養(yǎng)24 h顆粒細胞表現(xiàn)為晚期凋亡與壞死狀態(tài)者占50%以上，小卵泡壁層顆粒細胞的凋亡比例顯著高于中、大卵泡組。本研究表明，所用無血清培養(yǎng)體系可誘導(dǎo)豬各級有腔卵泡發(fā)生閉鎖，顆粒細胞凋亡是卵泡閉鎖的主要誘因，但卵泡閉鎖程度可因卵泡大小而異；卵泡大小不同，閉鎖過程中顆粒細胞死亡的程度也不同，小卵泡似乎更容易發(fā)生閉鎖。

Fas是一種細胞膜糖蛋白，F(xiàn)asL是Ⅱ類膜蛋白。Fas/FasL直接參與了細胞凋亡的調(diào)節(jié)，在各種動物的健康或閉鎖卵泡顆粒細胞均有表達，并在閉鎖卵泡高表達。健康卵泡的Fas定位在胞漿，而不是細胞膜，多以非活性狀態(tài)存在；當卵泡發(fā)生閉鎖時，F(xiàn)as從胞漿轉(zhuǎn)移到胞膜，與FasL結(jié)合引發(fā)顆粒細胞凋亡(Inoue et al, 2006)。在本實驗中，F(xiàn)as和FasL在豬各級有腔卵泡壁層顆粒細胞均有表達，在各級健康有腔卵泡的表達無差異；隨著顆粒細胞凋亡率的上升，它們的表達量增加，顯示出Fas/FasL系統(tǒng)對各級有腔卵泡閉鎖具有重要的調(diào)節(jié)作用，可被去除血清等所激活。

完整卵泡內(nèi)微環(huán)境對于維持顆粒細胞和卵母細胞的存活是必要的(Moor et al, 1998)。顆粒細胞間通過縫隙連接相互作用，顆粒細胞與卵母細胞間也通過透明帶以微絨毛相互聯(lián)系。卵母細胞與顆粒細胞的相互作用，對于決定卵泡命運起著重要的作用(Diaz et al, 2007)。Canipari et al(2000)認為，卵母細胞成熟與其后的胚胎發(fā)育能力取決于卵泡整體結(jié)構(gòu)的完整。Maillet et al(2003)分離兔健康卵泡顆粒細胞進行培養(yǎng)，并與體外培養(yǎng)的完整卵泡顆粒細胞凋亡情況進行對比，發(fā)現(xiàn)兩者對凋亡的敏感性不同，證明完整卵泡內(nèi)的旁分泌機制可能在抑制顆粒細胞凋亡方面發(fā)揮了作用。Dharma et al(2003)應(yīng)用馬絨毛膜促性腺激素（eCG）誘導(dǎo)小鼠卵泡閉鎖，證實在健康和閉鎖卵泡顆粒細胞中均有Fas/FasL mRNA和蛋白的表達，但在健康卵泡卵母細胞中未檢測到上述凋亡基因的表達，即使在閉鎖卵泡卵母細胞也只檢測到Fas的表達；認為顆粒細胞的FasL可與卵母細胞的Fas相結(jié)合，進而導(dǎo)致卵泡閉鎖。本實驗在卵泡培養(yǎng)的不同時間點收集壁層顆粒細胞時發(fā)現(xiàn)，卵丘?卵母細胞復(fù)合體（COC）的形態(tài)在培養(yǎng)的頭24 h，幾乎所有的卵母細胞都包裹3層以上的顆粒細胞，而培養(yǎng)16 h時卵泡液即變得不透明，培養(yǎng)24 h時鏡下可見卵泡壁層顆粒細胞不再成片連接、呈散在分布狀。經(jīng)過完整卵泡培養(yǎng)所獲的COC在進行卵母細胞成熟培養(yǎng)后，均未獲得成熟（待發(fā)表資料），暗示本實驗所用卵泡培養(yǎng)體系在誘導(dǎo)卵泡閉鎖后，可能對卵母細胞繼續(xù)發(fā)育造成了障礙。FasL mRNA在卵泡培養(yǎng)至24 h達最高，而Fas mRNA在卵泡培養(yǎng)至48 h達最高，可能暗示著配體對其受體的誘導(dǎo)作用。根據(jù)本實驗對豬的培養(yǎng)卵泡的觀察，培養(yǎng)16 h后中、小卵泡的卵泡液開始變得不透明，培養(yǎng)至24 h各組卵泡均表現(xiàn)為不透明，與此同時培養(yǎng)卵泡顆粒細胞的總凋亡率（早期凋亡＋晚期凋亡）在8 h就已達到70%以上，至24 h則為81.1%～94.6%。

在牛和豬上，雖有完整有腔卵泡的分離，但尚未見到分離卵泡培養(yǎng)的報道。Inoue et al(2006)研究了直徑3 mm左右卵泡顆粒細胞Fas/FasL mRNA的表達變化，發(fā)現(xiàn)Fas mRNA和FasL mRNA在豬健康與閉鎖卵泡中均有表達，但健康卵泡表達量較低，閉鎖時表達增加，且FasL mRNA表達增加顯著。在牛上，F(xiàn)as/FasL mRNA在閉鎖卵泡顆粒細胞和泡膜細胞均為高表達。應(yīng)用免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，在閉鎖卵泡中FasL蛋白在泡膜細胞濃染，而Fas蛋白則在顆粒細胞濃染，據(jù)此認為Fas/FasL對牛顆粒細胞和泡膜細胞有不同的調(diào)節(jié)方式，或存在調(diào)節(jié)Fas表達的其他機制(Porter et al, 2001)。本實驗在分離豬有腔卵泡的基礎(chǔ)上，通過體外培養(yǎng)來研究卵泡形態(tài)學(xué)變化，對卵泡培養(yǎng)過程中顆粒細胞的凋亡規(guī)律進行探討，是一種獨特的卵泡發(fā)育、閉鎖研究的體外實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

Alonso-Pozos I, Rosales-Torres AM, ávalos-Rodrígueza A, Vergara-Onofre M, Rosado-García A. 2003. Mechanism of granulosa cell death during follicular atresia depends on follicular size [J].Theriogenology, 60: 1071-1081.

Bridgham JT, Johnson AL. 2001. Expression and regulation of Fas antigen and tumor necrosis factor receptor type I in hen granulosa cells [J].Biol Reprod, 65: 733-739.

Canipari R. 2000. Oocyte--granulosa cell interactions[J].Hum Reprod Update,6(3): 279-289.

Chen Q, Yano T, Matsumi H, Osuga Y, Yano N, Xu J, Wada O, Koga K, Fujiwara T, Kugu K, Taketani Y. 2005. Cross-talk between Fas/Fas ligand system and nitric oxide in the pathway subserving granulosa cell apoptosis: a possible regulatory mechanism for ovarian follicle atresia [J].Endocrinology, 146: 808-815.

Dharma SJ, Kelkar RL, Nandedkar TD. 2003. Fas and Fas ligand protein and mRNA in normal and atretic mouse ovarian follicles [J].Reproduction, 126: 783-789.

Diaz FJ, Wigglesworth K, Eppig JJ. 2007. Oocytes determine cumulus cell lineage in mouse ovarian follicles [J].J Cell Sci,120: 1330-1340.

Guthrie HD, Garrett WM, Cooper BS. 1998. Follicle-stimulating hormone and insulin-like growth factor-I attenuate apoptosis in cultured porcine granulosa cells [J].Biol Reprod, 58: 390-396.

Inoue N, Maeda A, Matsuda-minehata F, Fukuta K, Manabe N. 2006. Expression and localization of Fas ligand and Fas during atresia in porcine ovarian follicles[J].J Reprod Dev, 52(6): 723-730.

Inoue N, Manabe N, Matsui T, Maeda A,Nakagawa S, Wada S, Miyamoto H. 2003. Roles of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand signaling pathway in granulosa cell apoptosis during atresia in pig ovaries [J].J Reprod Dev, 49: 313-321.

Jolly PD, Smith PR, Heath DA, Hudson NL, Lun S, Still LA, Watts CH, McNatty KP. 1997. Morphological evidence of apoptosis and the prevalence of apoptotic versus mitotic cells in the membrana granulosa of ovarian follicles during spontaneous and induced atresia in ewes [J].Biol Reprod, 56: 837-846.

Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△Ct method [J].Methods, 25: 402-408.

Maillet G, Benha?m A, Mittre H, Féral C. 2003. Involvement of theca cells and steroids in the regulation of granulosa cell apoptosis in rabbit preovulatory follicles [J].Reproduction,125(5): 709-716.

Manabe N, Goto Y, Matsuda-Minehata F, Inoue N, Maeda A, Sakamaki K, Miyano T. 2004. Regulation mechanism of selective atresia in porcine follicles: regulation of granulosa cell apoptosis during atresia [J].J Reprod Dev, 50(5): 493-514.

Matsuda-minehata F, Inoue N, Goto Y, Manabe N. 2006. The regulation of ovarian granulosa cell death by pro- and anti-apoptotic molecules [J].J Reprod Dev, 52(6): 695-705.

Moor RM, Dai Y, Lee C, Fulka J Jr. 1998. Oocyte maturation and embryonic failure [J].Hum Reprod Update, 4(3): 223-236.

Nakayama M, Manabe N, Inoue N, Matsui T, Miyamoto H. 2003. Changes in the expression of tumor necrosis factor (TNF)α, TNF ɑ receptor (TNFR) 2 and TNFR-associated factor 2 in granulosa cells during atresia in pig ovaries [J].Biol Reprod, 68: 530-535.

Nakayama M, Manabe N, Nishihara S, Miyamoto H. 2000. Species specific differences in apoptotic cell localization in granulosa and theca interna cells during follicular atresia in porcine and bovine ovaries [J].J Reprod Dev, 46: 147-156.

Parborell F, Irusta G, Vitale A, Gonzalez O, Pecci A, Tesone M. 2005. Gonadotropin-releasing hormone antagonist antide inhibits apoptosis of preovulatory follicle cells in rat ovary [J].Biol Reprod, 72: 659-666.

Porter DA, Vickers SL, Cowan RG, Huber SC, Quirk SM. 2000. Expression and function of Fas antigen vary in bovine granulosa and theca cells during ovarian follicular development and atresia [J].Biol Reprod, 62: 62-66.

Quirk SM, Cowan RG, Joshi SG, Henrikson KP. 1995. Fas antigen-mediated apoptosis in human granulosa/luteal cells[J].Biol Reprod, 52: 279-287.

Role of Fas/FasL on Apoptosis of Porcine Follicular Granulosa Cells Derived from Isolated Follicles During Culturein vitro

LIN Peng-Fei, HAO Yuan-Bing, GUO Hui-Li, LIU Hong-Lin, RUI Rong*

(College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing210095,China)

The whole antral follicles were isolated from porcine ovaries and classified as follows: healthy follicles (HF), early atretic follicles (EF) and progressed atretic follicles (PF). The isolated porcine follicles were used for routine histological section and HE staining after examination by eyesight. Morphological research shows that the accuracy rate of eyesight examination for HF is 92%. Healthy follicles were chosen for further experiment and divided into 3 groups: large follicles (?＞5 mm), medium follicles (3?5 mm) and small follicles (＜3 mm). All follicles were cultured for 8, 16 and 24 h, respectively and the apoptosis of of their granulosa cells were examined by Annexin V-FITC/PI double-labeling. It showed that the total apoptotic rate of granulosa cells derived from cultured follicles could reach over 70% at 8 h after culture and be 81.1% ? 94.6% at 24 h after culture. Granulosa cells from groups were collected at 0, 8, 16, 24, 48 and 72 h after culture without serum and used for the examination of expression of FasL and Fas mRNA with real time PCR SYBRgreen method. The expression level of FasL mRNA of granulosa cells from different size of follicles increased with culture time and reached the highest level at 24 h after culture (P＜0.05). Expression level of FasL mRNA of granulosa cells from small follicles was higher than those from large and medium follicles. There exists no difference for expression level of Fas mRNA of granulosa cells among groups before culture but significantly increased at 8 h after culture and reached the highest level at 48 h after culture. It showed in the present experiment that the follicular culture system without serum used could effectively induce the apoptosis of follicular granulosa cells. Cell apoptosis is the main cause of follicular atresia, the degree of which varied with the size of follicles. Small follicles seemed to be easier atretic than medium and large follicles.

Swine; Antral follicles; Granulosa cells; Apoptosis; Fas/FasL

林鵬飛（1982－），男，內(nèi)蒙古烏蒙人，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)博士研究生，研究方向為動物生殖生物學(xué)

Q959.842；Q952.4；Q245

A

0254-5853-(2010)03-0268-07

10.3724/SP.J.1141.2010.03268

2009-06-22；接受日期：2009-12-29

國家高技術(shù)研究與發(fā)展計劃（2008AA101003）；國家基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃“973”項目（2007CB947403）

*通訊作者(Corresponding author)，Tel：025-84395595，Email：rrui@njau.edu.cn