李艷青 智麗麗

(1,2.昌吉學(xué)院物理系 新疆 昌吉 831100)

原子力顯微鏡的原理及其在生命科學(xué)中的應(yīng)用

李艷青1智麗麗2

(1,2.昌吉學(xué)院物理系 新疆 昌吉 831100)

本文簡述了原子力顯微鏡的工作原理及其工作模式,并且闡述了每種工作模式的優(yōu)缺點(diǎn),著重介紹了原子力顯微鏡在生命科學(xué)中所發(fā)揮的重要作用,并指出了原子力顯微鏡在研究生物樣品過程中所存在的問題,以及原子力顯微鏡在生命科學(xué)中的發(fā)展前景。

原子力顯微鏡;工作模式;應(yīng)用

1 引言

光學(xué)顯微鏡的出現(xiàn)使人們能夠觀察到用肉眼看不到的物質(zhì)細(xì)節(jié),如生物細(xì)胞,因此它已經(jīng)成為生命科學(xué)研究必不可少的重要工具。但是普通的光學(xué)顯微鏡的分辨率受到衍射極限的限制,不可能分辨比λ/2(λ為光波波長)更小的物體,其分辨率的極限只能達(dá)到 4×10-7m,最大放大倍數(shù)只有 2000。隨后發(fā)明的電子顯微鏡雖然具有非常高的分辨率,但它難以精確地揭示物質(zhì)的表面微觀結(jié)構(gòu),其復(fù)雜的制樣要求限制了其在活性生物分子等方面的研究應(yīng)用。到了二十世紀(jì)八十年代,Binning和 Rohrer[1]發(fā)明了掃描隧道顯微鏡(scanning tunneling microscope,ST M),隨后,在掃描隧道顯微鏡的基礎(chǔ)上又發(fā)展起來了其他各種新型掃描探針型表面分析儀器 (SPM),原子力顯微鏡就是其中的一種。掃描探針顯微鏡(SPM)集光電子技術(shù)、激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)高速采集和控制,以及高分辨率圖形處理于一體,利用探針與樣品之間的電、光、磁力、熱等物理關(guān)系,獲得樣品表面和內(nèi)部信息。

1986年誕生了原子力顯微鏡 (atomic force microscope,AFM)[2],這種高分辨率的掃描探針顯微鏡能夠應(yīng)用到包括絕緣體在內(nèi)的各種樣品研究中。

2 原子力顯微鏡的工作原理及工作模式

2.1 原子力顯微鏡的工作原理

原子力顯微鏡(AFM)是Binnig等人在 ST M的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的掃描探針顯微鏡,它利用原子之間的范德華力來呈現(xiàn)樣品的表面特性,可獲取納米級分辨率的活生物體等表面結(jié)構(gòu)信息。

AFM有一個對力非常敏感的微懸臂,其尖端有一個微小的探針,當(dāng)針尖與樣品表面接觸的時候,針尖與樣品表面上的原子之間存在一個非常微弱的相互作用力使微懸臂彎曲,該形變信號轉(zhuǎn)變?yōu)楣怆娦盘柌⑦M(jìn)行放大,就可以得到原子之間相互作用力的信號。AF M通過測量探針針尖與樣品表面原子間力的大小來描繪樣品的表面形貌,它不受樣品是否具有導(dǎo)電性的限制,可以對導(dǎo)體、半導(dǎo)體和絕緣體進(jìn)行測量,因此AFM的出現(xiàn)補(bǔ)償了 ST M不能觀測絕緣體的缺陷,為生命科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展做出了很大貢獻(xiàn)。圖1為AFM工作原理及儀器結(jié)構(gòu)示意圖。

2.2 原子力顯微鏡的工作模式

根據(jù)原子間作用力(引力或斥力)的不同,AFM成像分為接觸模式(Contact mode AFM,C-AFM)、非接觸模式 (Non-Contact mode AFM,NC-AFM)和輕敲模式 (Inter mittent-contact(tapping mode) AFM,T M-AFM)三種工作模式,如圖 2。

接觸模式中,針尖和樣品表面之間的距離僅有幾個埃,針尖與樣品之間的作用力在范德華力的排斥區(qū)域。非接觸模式中,針尖與樣品表面之間的距離是 50-100埃,針尖與樣品之間的作用力在范德華力的吸引區(qū)域。當(dāng)針尖與樣品之間的作用力在范德華力的吸引和排斥區(qū)域之間的時候,此工作模式被稱為輕敲模式,針尖與樣品表面之間的距離大約是 10-50埃。圖 3為原子間的 Lennard-Jones曲線,在圖中可以看出有三個區(qū)域:(l)接觸區(qū)域,代表的是AF M接觸模式;(2)非接觸區(qū)域,代表AFM非接觸模式;(3)在接觸區(qū)和非接觸區(qū)兩者之間區(qū)域,代表 T M-AFM模式。

圖 3 原子間力一距離曲線

接觸模式下,針尖前端的單個原子與樣品表面的單個原子之間存在排斥力,敏感的微懸臂因?yàn)榕懦饬Πl(fā)生彎曲。利用這一現(xiàn)象可以測量出原子間接近時的相互排斥力,一般可以測得兩個原子之間的力為 10-8N左右。接觸的情況下由于摩擦力的存在可以引起懸臂的偏轉(zhuǎn),不同的摩擦力使懸臂的偏轉(zhuǎn)不同,運(yùn)用該特點(diǎn)可以來檢測針尖與樣品表面之間摩擦力的大小,一般可以測得摩擦力的大小 10-11N左右。此模式下,針尖與樣品的距離比較近,成像的分辨率高。但是,當(dāng)掃描軟樣品時,針尖和樣品表面強(qiáng)的排斥力會造成樣品原子位置的改變,引起軟樣品的損傷;同時,軟樣品的原子容易粘附在探針針尖上,污染針尖不利于成像,所以,接觸模式一般不適合掃描軟樣品,例如:生物大分子、低彈性模量以及容易移動和變形的樣品。

非接觸模式下針尖與樣品表面距離較遠(yuǎn),相互作用力較弱,有利于研究軟生物樣品。但是,該模式下針尖與樣品之間的距離較遠(yuǎn),分辨率相比接觸模式和輕敲模式將降低,而且成像很不穩(wěn)定,操作相對困難,在生物研究中很少使用。

處在兩者之間的被稱為輕敲模式(Tapping mode AFM,T M-AFM)。輕敲模式類似于非接觸模式,但是,輕敲模式下微懸臂的共振頻率的振幅比較大,一般在 20nm左右,AFM的針尖在振蕩的時候與樣品的表面只是輕輕接觸,因此被稱作輕敲模式。由于輕敲模式能夠避免針尖粘附到樣品上,以及在掃描過程中對樣品幾乎沒有損壞,所以輕敲模式可以對液體中活性生物樣品進(jìn)行現(xiàn)場檢測、對溶液反應(yīng)進(jìn)行現(xiàn)場跟蹤等。

3 原子力顯微鏡在生命科學(xué)中的應(yīng)用

原子力顯微鏡(AF M)不僅僅能對單個分子進(jìn)行觀測,而且還能對單個分子進(jìn)行自由操縱[3]。到目前為止AFM的研究已從原子、小分子、有機(jī)分子、高分子直至生物分子,涉及到生物技術(shù)、微探測及納米技術(shù)、微電子技術(shù)、實(shí)際生產(chǎn)等方面,其在物理、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料學(xué)以及微電子學(xué)等方面都有廣泛的應(yīng)用前景,特別是在生物大分子的觀察與操縱方面已經(jīng)取得了很大進(jìn)展。

原子力顯微鏡已經(jīng)在生命科學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[4]。自從 Lindsay等人首次用 AFM獲得DNA分子的圖像以來,AFM已經(jīng)成為研究DNA分子的重要工具。Hans ma等人首次在丙醇中得到了質(zhì)粒DNA可重復(fù)的AFM圖像,他們通過AFM切割遺傳物質(zhì)脫氧核糖核酸分子的指定位置,這是人們第一次利用AFM對生物分子進(jìn)行的可控制性的納米操縱[5]。vesenka等人[6]在大氣的環(huán)境下獲得了脫氧核糖核酸的重復(fù)性的AF M圖像。最近幾年以來,通過改善AFM樣品制備方法,改進(jìn)探針針尖的分子修飾,更重要的通過 T M-AFM成像,一些科研工作者獲得超分辨的DNA以及DNA的復(fù)合物的圖像[7]。目前,原子力顯微鏡還不能解決DNA分子的核苷酸序列,但是,通過原子力顯微鏡已經(jīng)研究出了高級DNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合物,并且可以研究單個DNA分子的長度、寬度和高度。Martin等人[8]用AF M實(shí)時觀察到了環(huán)狀和棒狀DNA聚合體的自組裝、DNA聚合體的運(yùn)動和結(jié)構(gòu)的變化過程。

首先用原子力顯微鏡研究的蛋白質(zhì)是 halobacterium halobim的紫膜上的視紫紅蛋白[9]。對于一些游離蛋白質(zhì),科學(xué)家們也在這方面獲得了很大的成功,例如:膠原蛋白、免疫蛋白、肌動蛋白、蛋白聚合酶和巨球蛋白等等[10]。由于AFM能在液體和近生理?xiàng)l件下獲得高分辨的形貌圖,因此,在蛋白質(zhì)成像方面得到了廣泛的應(yīng)用,主要有:研究蛋白分子形狀的改變,觀察蛋白質(zhì)的微觀內(nèi)部構(gòu)造,探索蛋白質(zhì)的動力學(xué)過程,實(shí)時觀測蛋白質(zhì)的自組裝過程,進(jìn)行原子力顯微鏡的單分子操縱、檢測蛋白質(zhì)的表面特性等[11-13]。

原子力顯微鏡在多糖方面的研究起步比較晚,多糖都具有很大的分子量,支鏈較多,在溶解方面比較困難,均一性較差,因此,形貌圖的效果比較差,分辨率低。但是,最近原子力顯微鏡在多糖方面的研究取得了很大進(jìn)展[14]。馬秀俐等人[15]利用原子力顯微鏡觀測到西洋參多糖的分子鏈為多股形狀并且緊密并行螺旋排列,每股螺旋直徑約為 200-250nm左右。Round等人[16]利用原子力顯微鏡研究了果膠多糖的支鏈結(jié)構(gòu)和相互交織的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),支鏈的存在直接影響果膠多糖的粘度性質(zhì),即便在很低的濃度下,仍然可以看到單個聚集體的存在。李艷青等人[17]利用原子力顯微鏡研究了多糖黃原膠分子,觀測出該糖微觀結(jié)構(gòu)隨溫度和退火時間有著規(guī)律性的變化,為生物體組織再造提供了一個有效的途徑。

以上實(shí)驗(yàn)均通過AFM得到高分辨率的形貌圖像,由于原子力顯微鏡可在液態(tài)環(huán)境中工作,所以AFM可對活細(xì)胞進(jìn)行觀測其動態(tài)生化反應(yīng),分辨率橫向高達(dá) 10-10×10-11m,這些圖像利用電子顯微鏡是不易觀察到的。

4 原子力顯微鏡研究生物樣品時存在的問題

原子力顯微鏡雖能夠觀測到單個原子,但這是受一定的條件制約的,在觀測生物大分子時,遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到這樣的分辨率,主要原因在于進(jìn)行原子力顯微鏡掃描時一般采用輕敲模式,該模式下幾乎無法得到原子量級的圖像,如果利用接觸模式,對生物樣品會存在損害。另一方面,針尖的曲率半徑是影響原子力顯微鏡分辨率的一個重要因素,經(jīng)過幾十年的發(fā)展,新型碳納米管針尖可以大大改善針尖曲率半徑對分辨率的影響。因此碳納米管針尖是AFM探針的未來發(fā)展的一個重要方向。

通常情況下原子力顯微鏡的掃描速度比較低,需要幾分鐘的時間才能得到一個高分辨率的圖像。然而,對于很多的化學(xué)反應(yīng)都是在很短的時間內(nèi)完成的,因此,原子力顯微鏡不能實(shí)時觀測化學(xué)反應(yīng)的變化,有待科學(xué)界進(jìn)一步探究。

5 結(jié)論與展望

AFM在不同的工作模式,不同的環(huán)境下可以得到生物的表面形貌,表面特性以及動力學(xué)過程等信息,它已經(jīng)成為研究生命科學(xué)領(lǐng)域中不可缺少的有力工具,隨著研究的深入,必將促進(jìn)生物科學(xué)進(jìn)入新的發(fā)展時代。

近年來,隨著科學(xué)技術(shù)的不斷改進(jìn)和發(fā)展,許多新的 AFM工作模式 (如磁場操作模式 MACAFM)[18]不斷涌現(xiàn),使得AFM所得圖像更接近于真實(shí)圖像,而且,對樣品破壞程度大大降低。另一方面,AFM與其他技術(shù)聯(lián)用(如電子顯微鏡),將會進(jìn)一步提高對生命科學(xué)的研究能力,AFM的功能以及應(yīng)用范圍也將不斷的擴(kuò)大和深入,必將推動科學(xué)的巨大進(jìn)步。

[1]G.Binnig,H.Rohrer,C.Gerber,E.Weibel.Appl.Phys.Lett.,1982,40:178.

[2]G.Binning,C.F.Quate,C.Gerber,Phys.Rev.Lett.,1986,56:930.

[3]H.G.Hansma et al.,Science,1992,256:1180.

[4]G.U.Lee,L.A.Chrisey.,Science,1994,266:771.

[5]H.G.Hansma,J.Vesenka,C.Siegerist.et al,Science,1992,256:1180.

[6]J.Vesenka,M.Guthold,C.L.Tang.et al,Ultramicroscopy,1992,42-44:1243.

[7]Han W,Lindsay S M,Dlakic M,Harrington R E.nature,1997,386:563.

[8]A.L.Martin,M.C.Davies,B.J.Raekstraw.et al,.FEBS Letters,2000,480:106

[9]Butt H J,Downing K H,Hans ma P K.Biophysical J,1990,58:1473.

[10]Arakawa H,Umemura K,Ikai A.Nature,1992,358:171.

[11]G.M.Hand,D.J.Muller,B.Nieho1Son.et al,J.Mol.Biol,2001,315:587.

[12]M.KamermanS,I.Fahrenfort,K.SchultZ.et al,Science,2001,292:1178.

[13]J. I.Kourie,H.B.Wood.Prog,Biophys.Mol.Biol,2000,73:91.

[14]Kirby A R,Gunning A P.Morris V J.biopolymers.1996,38:355.

[15]馬秀俐,白玉白,劉忠英等.西洋參多糖(PPQ-d)的原子力顯微鏡觀察[J].吉林大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào),2000,(1): 105.

[16]Round A N,Rigby N M.et al,Carbohydrate Research.2001,331:337.

[17]Yanqing Li. et al,Colloids and Surfaces B:Biointerfaces 2009,74:136.

[18]Ge G,Han D,Lin D.et a1,Ultramicroscopy,2007,107:299.

O561.1;TG115.21+5.7

A

1671-6469(2010)03-0112-05

2010-05-17

昌吉學(xué)院院級課題(2010SSQD021和 2010SSQD020)

李艷青 (1982-),男,河南省項(xiàng)城市人,昌吉學(xué)院物理系,助教,研究方向:原子力顯微鏡對生物大分子的研究。

(責(zé)任編輯:代琴)