楊 勛，劉洋洋，時(shí) 杰，許瓊情，劉平懷

（海南大學(xué)材料與化工學(xué)院 海南優(yōu)勢資源化工材料應(yīng)用技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228）

海參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的分析研究

楊 勛，劉洋洋，時(shí) 杰，許瓊情，劉平懷*

（海南大學(xué)材料與化工學(xué)院 海南優(yōu)勢資源化工材料應(yīng)用技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 570228）

研究海參主要活性成分的定量分析方法，并應(yīng)用于海參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定.試驗(yàn)采用分光光度法測定并計(jì)算海參皂苷及多糖含量，海參皂苷及多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為Y=1.3876X-0.0161（R2=0.9994）和Y=0.0454X+0.2487（R2=0.9989），在一定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.該方法簡單，穩(wěn)定性好，可分別用于測定海參藥材中總皂苷和總多糖含量.將總皂苷與總多糖含量兩個(gè)指標(biāo)作為海參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的限度，對規(guī)范海參藥材質(zhì)量具有一定的參考價(jià)值.

海參；皂苷；多糖；分光光度法；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

海參為棘皮動(dòng)物門（Echinodermata）海參綱（Holothurioidea）動(dòng)物，在中國多個(gè)海域有分布，僅中國南海就有30多種，西沙群島居多，溫帶海區(qū)以山東半島和遼東半島為主[1-5].海參營養(yǎng)豐富并含有多種生物活性物質(zhì)，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值，明代《食物本草》指出海參有主補(bǔ)元?dú)?、滋益五臟六腑虛損的養(yǎng)生功能，清代《本草綱目拾遺》將海參列為補(bǔ)益藥物.現(xiàn)代科學(xué)研究表明，在海參體內(nèi)，主要含有兩種有效成分，即海參皂苷和海參多糖成分，能夠起到增強(qiáng)人體免疫，抗疲勞，抗腫瘤的作用[1].海參作為一種名貴的滋補(bǔ)藥材，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未加以規(guī)范，這給海參藥材的質(zhì)量控制及規(guī)模化生產(chǎn)帶來了不便.本文通過對海參主要活性物質(zhì)的含量進(jìn)行定量測定，旨在探討一種適合海參活性成分的定量測定方法，為海參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[6-7]制定提供一定的依據(jù).

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

TU-1810PC紫外可見光分光光度計(jì)（北京普析通用儀器公司），香草醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），高氯酸（天津鑫源化工廠），天青Ⅰ試劑（溫州市化學(xué)試劑有限公司）.Echinoside A（海參三萜皂苷），海參多糖均為實(shí)驗(yàn)室制備.

實(shí)驗(yàn)所用海參采自海南省萬寧市日月灣海域，經(jīng)海南大學(xué)生物工程系劉平懷教授鑒定為花刺參Stichopus Uariegatus（Sempen）.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品液的制備

（1）海參總皂苷溶液的制備.取干燥的海參2 g用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇提取，后用正丁醇萃取，取正丁醇段揮發(fā)干，得到海參樣品總皂苷.用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶解并定容至100 mL.制成皂苷液備用.

（2）海參多糖溶液的制備.海參勻漿加入蛋白酶完全水解，離心，得到的上清液加蒸餾水到一定濃度[8-11].

1.2.2 測定波長的確定

（1）Echinoside A測定波長確定.皂苷類物質(zhì)與香草醛-高氯酸反應(yīng)，生成共軛雙鍵系統(tǒng)，在酸性條件下形成陽碳離子鹽而顯色，在紫外光下有特定的吸收波長.精確稱量Echinoside A 0.7 mg，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液及0.8 mL高氯酸，60℃水浴15 min，冰水冷卻，加冰醋酸5 mL，搖勻，用紫外可見光分光光度計(jì)于波長400-700 nm掃描，在波長560 nm處出現(xiàn)峰值（見圖1）.確定測定波長為560 nm.以該反應(yīng)體系未加Echinoside A為空白對照[12-15].

圖1Echinoside A波長掃描圖Fig.1The absorbance spectra of Echinoside A

（2）海參多糖液測定波長確定.海參多糖和天青I試劑特異性結(jié)合，生成藍(lán)紫色物質(zhì)，該藍(lán)紫色物質(zhì)在515 nm處有最大吸收[9-10].因此，測定海參總多糖與天青I試劑結(jié)合物在515 nm下的吸收值，可以間接對海參多糖進(jìn)行定量分析.

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

（1）海參皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制.精確稱量Echino?side A 10.5 mg用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶解后定容至10 mL配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液.分別量取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL至瓶中，90℃揮干溶劑.加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液及0.8 mL高氯酸，60℃水浴15 min，冰水冷卻，加冰醋酸5 mL，搖勻，分別于560 nm處測吸光值，重復(fù)測量，取平均值，該反應(yīng)體系未加Echinoside A為空白對照.以Echinoside A 含量（mg）為橫坐標(biāo)（X），吸光值為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

（2）海參多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制.精密稱取海參多糖用蒸餾水配制成0.25 mg/L溶液.天青I試液：取天青I試劑0.5 g，以蒸餾水稀釋至500 mL，放置7 d.過濾除去不溶物，得天青I儲(chǔ)備液，冷藏保存.臨用時(shí)取儲(chǔ)備液1 mL加蒸餾水至加20 mL.精密量取海參多糖標(biāo)準(zhǔn)溶液10、20、30、40、50 μL分別加水至50 μL，依次加入天青I試液5.0 mL，混勻后10 min內(nèi)于515 nm波長處測定吸光值，該反應(yīng)體系未加海參多糖為空白對照.以多糖含量（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），吸光值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.2.4 測定方法穩(wěn)定性試驗(yàn)

（1）皂苷穩(wěn)定性.連續(xù)測定0.2 mL的Echino?side A標(biāo)準(zhǔn)液5次，方法同1.2.3，計(jì)算SD和CV值.該方法的SD=0.73%，CV=2.61%.結(jié)果表明該方法穩(wěn)定可靠.

（2）多糖穩(wěn)定性.取濃度0.10 mg/mL的海參多糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL，加入天青Ⅰ試液50 mL，混勻后平均分成10份，每隔1 h測定1次含量，計(jì)算RSD值.計(jì)算得到RSD值0.56%，表明此方法的成色物質(zhì)在10 h內(nèi)穩(wěn)定.

1.2.5 含量測定

（1）總皂苷含量測定.取一定量總皂苷液按1.2.3的方法測其吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算皂苷含量.取不同量的重復(fù)測量，計(jì)算后取平均值.

（2）多糖含量的測定.精密量取供試多糖樣品1.0 mL置于10 mL容量瓶中以水定容，搖勻，得樣品液.量取25 μL樣品液，加入天青Ⅰ試液5.0 mL，混勻后10 min內(nèi)于515 nm波長處測定吸光值，以水作為空白對照.如果樣品的吸光值在量程范圍內(nèi)，則參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量；否則將稀釋樣品的濃度作適當(dāng)調(diào)整，使吸光值最終落在線性范圍內(nèi).

2 結(jié)果與討論

2.1 皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

以Echinoside A的質(zhì)量（mg）為X，吸光值為Y，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=1.3876X-0.0161，相關(guān)系數(shù)R2=0.9994.在0-0.6 mg之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系.結(jié)果見圖2.

圖2 皂苷濃度與吸光值關(guān)系Fig.2Relation between concentration of Echinoside A and absorption

2.2 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以多糖含量(μg/ml)為橫坐標(biāo)（X），吸光值為縱坐標(biāo)（Y），繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.0454X+0.2487，R2=0.9989，在5.0-21.0 μg之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系.結(jié)果見圖3.

圖3 多糖濃度與吸光值關(guān)系Fig.3Relation between concentration of polysaccharide and absorption

3 討論

海參多糖和皂苷對海參食用及藥用價(jià)值影響很大，是不可或缺的海參營養(yǎng)評價(jià)指標(biāo).海參多糖是海參體壁的重要組成成分，其含量約占干海參有機(jī)物總量的6%以上.國內(nèi)外研究表明，海參體壁多糖主要為海參糖胺聚糖（Glycosaminoglycan，GAG）或稱粘多糖（Holothurian Glycosaminoglycan，HG），另一種海參巖藻多糖（Holothurian Fucan，HF）[16].海參皂苷的種類很多，其結(jié)構(gòu)多數(shù)為羊毛甾烷型三萜皂苷，且絕大多數(shù)具有藥理活性[17-18].

使用天青I試劑與多糖特異性結(jié)合及香草醛-高氯酸試劑與皂苷特異性結(jié)合在特定波長下的特征吸收值來對其含量進(jìn)行定量分析，這種方法在一定的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，且穩(wěn)定性好.實(shí)驗(yàn)所用海參多糖及Echinoside A均為實(shí)驗(yàn)室制備，用作標(biāo)準(zhǔn)品能夠準(zhǔn)確的測定海參多糖及皂苷含量，且純度要求不是很高，制備方法簡單可行.本文提到定量測定多種類型物質(zhì)成分含量作為藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，對于復(fù)雜成分的中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定有一定的參考價(jià)值.

4 結(jié)論

海參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[19]：本品為花刺參Stichopus Uarie?gatus（Sempen）的干燥體.海參捕得后，除去內(nèi)臟，洗凈腔內(nèi)泥沙，入適當(dāng)?shù)柠}水中燒煮約1 h，撈起放冷，經(jīng)曝曬或烘焙至八、九成干時(shí)，再入蓬葉液中略煮，至顏色轉(zhuǎn)黑時(shí)，取出曬干.

性狀：本品肉質(zhì)厚嫩.體稍呈方柱形，一般長30-40 cm，最長可達(dá)95 cm.背面散生多數(shù)圓錐形和排列不規(guī)則的肉刺.腹面管足排列成3縱帶，喘帶較寬，觸手20個(gè).皮的內(nèi)片：第1種為桌形體，基塔部頂端具12個(gè)向外擴(kuò)張的小齒，它的底盤小，略帶方形，中央常有4個(gè)大孔，周圍有4個(gè)或4個(gè)以上的小孔；底盤較大的桌形體，其周圍小孔也較多.第2種骨片是大小不等的C形體.第3種似為數(shù)個(gè)C形體連接組成的花紋樣體.形態(tài)特征：體呈圓筒狀，長10～20 cm，特大的可達(dá)30 cm.觸手輪形，17～30個(gè)，一般為20個(gè).觸手壇囊發(fā)達(dá).口在前端，多偏于腹面.肛門在后端，多偏于背面.背面一般有疣足，腹面有管足.

檢查：水分按照水分測定法（參照《中國藥典》2005版附錄ⅨH第一法）測定.總灰分參照《中國藥典》2005版附錄ⅨK.酸不溶性灰分參照《中國藥典》2005版附錄ⅨK.

浸出物：照浸出物測定法項(xiàng)下的熱浸法（參照《中國藥典》2005版附錄ⅩA）測定，用水溶性測定法或醇溶性測定法待定.

含量測定：總皂苷（1）皂苷液的制備：取干燥的海參2 g用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇提取，后用正丁醇萃取，取正丁醇段揮發(fā)干，得到海參樣品總皂苷.用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶解并定容至100 mL.制成皂苷液備用.（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精確稱量Echinoside A 10.5 mg用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇定容10 mL配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液.分別量取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL至瓶中，90℃揮干溶劑.加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液及0.8 mL高氯酸，60℃水浴15 min，冰水冷卻，加冰醋酸5 mL，搖勻.照紫外-可見光分光光度法（2005版藥典附錄V A）分別于560 nm處測吸光值，重復(fù)測量，取平均值.以Echinoside A含量為橫坐標(biāo)（X），吸光值為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.（3）測量：取一定量總皂苷液90℃揮干溶劑.加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液及0.8mL高氯酸，60℃水浴15 min，冰水冷卻，加冰醋酸5 mL，搖勻.測其吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算皂苷含量.

總多糖：（1）多糖液的制備：將海參勻漿加入蛋白酶完全水解，離心，得到的上清液加水到一定濃度.（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密稱取海參多糖標(biāo)準(zhǔn)品用水配制成0.25 mg/L溶液.天青I試液：取天青I試劑0.5 g，以水稀釋至500 mL，放置7 d.過濾除去不溶物，得天青I儲(chǔ)備液，冷藏保存.臨用時(shí)取儲(chǔ)備液1 mL加水至加20 mL.精密量取海參多糖標(biāo)準(zhǔn)溶液10、20、30、40、50 μL分別加水至50 μL，依次加入天青I試液5.0 mL，混勻后10 min內(nèi)于照紫外-可見光分光光度法（2005版藥典附錄V A）于515 nm波長處測定吸光值，以多糖含量為橫坐標(biāo)（X），吸光值為縱坐標(biāo)（Y）.以水為空白對照，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.（3）測量：精密量取供試多糖樣品1.0 mL置于10 mL容量瓶中以水定容，搖勻，得樣品液.量取25 μL樣品液，加入天青I試液5.0 mL，混勻后10 min內(nèi)于515 nm波長處測定吸光值，以水作為空白對照.如果樣品的吸光值在量程范圍內(nèi)，則參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量；否則將稀釋樣品的濃度作適當(dāng)調(diào)整，以使吸光值最終落在量程范圍內(nèi).根據(jù)測得吸光值依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量.

炮制：以水瀹胖，剖去肚雜泥沙用.現(xiàn)行，取原藥材，除去雜質(zhì)，洗，切厚片或段，干燥.先從肛門處挑一小口，放凈體內(nèi)的內(nèi)臟，經(jīng)沸水浴處理后，控凈水，涼透后加入適量的粗鹽拌均勻（一般500 g海參加鹽550-750 g），腌漬8 h后，撈出控凈水，加入草木灰拌勻，攤放在陰涼透風(fēng)處晾干（加工廠一般用紫外線烘干），拍凈海參表面的草木灰裝袋即成.貯藏：置干燥處，防蛀.

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Study on the Quality Standards of Sea Cucumbers

YANG Xun，LIU Yangyang，SHI Jie，XU Qiongqing，LIU Pinghuai*
（Ministry of Education Key Laboratory of Application Technology of Hainan Superior Resources Chemical Materials，College of Materials and Chemical Engineering,Hainan University，Haikou570228，China）

We developed a quantitative analysis method of the main active ingredients of sea cucumber,and used this method to formulate the quality standards of sea cucumber.We calculated saponins and polysaccharides content of sea cucumber by measuring with spectrophotometry.The standard function were Y=1.3876X-0.0161,(R2=0.9994)and Y=0.0454X+0.2487,(R2=0.9989)respectively,which have good linear relationship within a certain concentration.So the method can be used to measure the saponins and polysaccharides content of sea cucumber with simplicity and good sta?bility.Using the total saponin and polysaccharide content as the quality standards of sea cucumbers can provide refer?ence for the specification of the quality of sea cucumbers.

sea cucumbers；saponins;polysaccharides；spectrophotometry；quality standard

R 282.7

A

1674-4942（2010）04-0423-04

2010-08-17

海南省重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目（06202）；2006年度海口市重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目

*通訊作者

畢和平