李改仙，李建晴*，衛(wèi)艷麗

（1.晉中學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，山西 晉中 030600；2.山西大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程研究中心，山西 太原 030006）

熒光法研究茶堿與牛血清白蛋白的相互作用

李改仙1，李建晴1*，衛(wèi)艷麗2

（1.晉中學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，山西 晉中 030600；2.山西大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程研究中心，山西 太原 030006）

應(yīng)用熒光和紫外光譜法研究了茶堿（TH）與牛血清白蛋白（BSA）相互作用的光譜特性.測(cè)定了TH與BSA在10℃、28℃和40℃溫度下的結(jié)合常數(shù)KA分別為1.96×104L/mol、3.80×104L/mol,1.57×105L/mol，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n分別為1.0，1.1，1.2.實(shí)驗(yàn)表明：TH對(duì)BSA內(nèi)源熒光的猝滅機(jī)理主要為靜態(tài)猝滅；計(jì)算得到熱力學(xué)參數(shù)H為26.229 KJ/mol，S為174.809 J/（mol·K）.TH主要以疏水作用力與BSA相互作用；同步熒光技術(shù)研究表明，BSA的熒光主要源于TH色氨酸殘基，表明TH對(duì)BSA的構(gòu)象有影響.

茶堿；牛血清白蛋白；熒光光譜法；紫外光譜；靜態(tài)猝滅

茶堿（Theophylline，TH）屬黃嘌呤甲基衍生物，是目前常用的平喘藥之一，具有較強(qiáng)和持久的利尿作用，以及擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、興奮心肌的作用[1].血清白蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，具有貯運(yùn)內(nèi)源代謝產(chǎn)物和外源藥物小分子等重要生理功能.因此進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量測(cè)定，研究蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)的相互作用具有十分重要的意義[2-3].本文運(yùn)用熒光光譜、紫外可見光譜研究了茶堿與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用，基于熒光猝滅現(xiàn)象計(jì)算了TH與BSA的表觀結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，從藥物小分子結(jié)構(gòu)角度討論了藥物-蛋白質(zhì)作用規(guī)律，進(jìn)一步對(duì)黃嘌呤甲基衍生物類藥物與BSA作用機(jī)理的研究提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CARY Eclipse熒光分光光度計(jì)（自帶恒溫裝置，美國VARIAN公司）；pHS-2ST數(shù)顯酸度計(jì)（上海天達(dá)儀器有限公司）.

茶堿（SIGMA公司，配成1.0×10-3mol/L的儲(chǔ)備液，使用時(shí)稀釋），牛血清白蛋白（BSA，上海伯奧生物科技有限公司，配成1.0×10-4mol/L的儲(chǔ)備液，使用時(shí)適當(dāng)稀釋），Britton-Robison緩沖溶液.其余藥品均為分析純.實(shí)驗(yàn)用水為亞沸二次蒸餾水.所用溶液于4℃下保存.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 TH-BSA的熒光光譜

10 mL比色管中依次加入1.0 mLBSA儲(chǔ)備液、不同量的TH儲(chǔ)備液、2 mLpH=7.4的B-R緩沖溶液，蒸餾水定容，室溫下放置30 min.在λex/λem=280/350 nm處掃描BSA的熒光光譜及BSA在TH作用下的熒光猝滅光譜.在Δλ=15 nm和Δλ=60 nm掃描酪氨酸和色氨酸的同步熒光光譜.1 cm比色皿，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5.0 nm.

1.2.2 TH-BSA的紫外光譜

10 mL比色管中依次加入0.5 mLTH儲(chǔ)備液，不同量的BSA儲(chǔ)備液，3.0 mL pH=7.4的B-R緩沖溶液，蒸餾水定容，以與試樣中BSA濃度相對(duì)應(yīng)的BSA溶液作參比，放置30 min.在室溫下，考察不同濃度BSA對(duì)TH紫外吸收光譜的影響.

2 結(jié)果與討論

2.1 TH-BSA的熒光光譜

選用pH=7.4的酸度條件，固定BSA的濃度，改變TH的濃度，測(cè)得含不同濃度TH時(shí)BSA熒光光譜如圖1.由圖1可見，隨著TH的濃度的增加，BSA的熒光逐步被猝滅.BSA的峰形變化不大，發(fā)射峰的位置λem沒有顯著移動(dòng)，表明TH與BSA發(fā)生了作用.

圖1TH對(duì)BSA的熒光猝滅光譜Fig.1Fluorescence spectra of BSA with TH CTH=0,0.5,1.0,1.5,2.0,3.0,4.0,5.0(ⅹ10-5mol/L)CBSA=1.0ⅹ10-5mol/L

2.2 BSA的熒光猝滅機(jī)理及猝滅常數(shù)的確定

引起B(yǎng)SA熒光猝滅有靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅[4]，動(dòng)態(tài)猝滅符合Stern-Volmer方程：F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q].靜態(tài)猝滅符合Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)方程：1/（F0/F）=1/F0+KD/（F0[Q]）.分別測(cè)定10、28、40℃下TH與BSA的熒光猝滅光譜，以F0/F對(duì)[Q]作Stern-Volmer曲線.以（F0-F）-1對(duì)[Q]-1作Lineweav?er-Burk雙倒數(shù)曲線.其線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)r見表1，猝滅常數(shù)KSV及解離常數(shù)KD見表2.

表1 Stern-Volmer和Lineweaver-Burk線性方程和相關(guān)系數(shù)Tab.1 Regression equations and correlation coefficients

表2 猝滅反應(yīng)常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)Tab.2Quenching constants and thermodynamic parameters

2.3 TH與BSA作用的結(jié)合常數(shù)KA、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n[5]

假設(shè)探針小分子Q與生物大分子B存在n個(gè)等同且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，Q與B之間相互作用關(guān)系符合Langmuir單分子吸附模型：log（（F0-F）/F）=log?KA+nlog[Q].由log((F0-F)/F)對(duì)log[Q]作圖，由直線截距可得結(jié)合常數(shù)KA，斜率可求得結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，不同溫度下的結(jié)果見表3.

2.4 TH與BSA作用方式的熱力學(xué)研究

探針小分子與蛋白質(zhì)之間的作用力包括氫鍵作用力，范德華力，靜電作用和疏水作用[6].由Gibbs-Helmholtz方程lnK=-ΔH/RT+ΔS/R計(jì)算可得其熱力學(xué)參數(shù)進(jìn)行推斷.實(shí)驗(yàn)條件下的KA值（表3）所示，以lnK對(duì)1/T作圖.由直線的斜率和截距可計(jì)算出TH與BSA作用的熱力學(xué)函數(shù)，結(jié)果見表2.結(jié)果表明：TH與BSA之間的作用力主要以疏水作用為主[7].

表3 不同溫度下TH與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)與結(jié)合常數(shù)Tab.3Binding constants and sites of BSA with TH under different temperatures

2.5 TH對(duì)BSA構(gòu)象的影響

蛋白質(zhì)在溶液中存在同分異構(gòu)體，隨溶液環(huán)境的變化表現(xiàn)出可以逆轉(zhuǎn)的構(gòu)象.由Δλ=15 nm所得的同步熒光只顯示蛋白質(zhì)酪氨酸殘基的熒光.Δλ=60 nm所得的同步熒光只顯示蛋白質(zhì)色氨酸殘基的熒光[8].圖2、3分別為TH存在時(shí)BSA酪氨酸和色氨酸殘基的熒光光譜.由于藥物分子與BSA的結(jié)合，導(dǎo)致BSA的色氨酸殘基所處環(huán)境的疏水性降低，最大發(fā)射波長發(fā)生紅移.TH存在時(shí)酪氨酸殘基的發(fā)射波長也略有移動(dòng).在此實(shí)驗(yàn)條件下，BSA的熒光主要來源于色氨酸殘基，藥物分子的加入引起了BSA構(gòu)象的變化.

圖2TH存在下BSA的同步熒光光譜，Δλ=15nmFig.2 The synchronal fluorescence spectra of BSA CTH=0，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，5.0(10-5mol/L)，CBSA=1ⅹ10-5mol/L

2.6 TH與BSA相互作用的紫外光譜法驗(yàn)證研究[9-10]

依據(jù)實(shí)驗(yàn)方法得到TH與不同濃度BSA結(jié)合后的紫外吸收光譜圖（圖4）.BSA與TH的結(jié)合常數(shù)，可以通過BSA與TH相互作用前后的吸光度值與BSA濃度之間的關(guān)系求出：

其中A0為BSA不存在時(shí)的體系吸光度，A為加入不同量BSA后體系的吸光度.

圖3TH存在下BSA的同步熒光光譜,Δλ=60nmFig.3 The synchronal fluorescence spectra of BSA CTH=0，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，5.0(10-5mol/L)，CBSA=1ⅹ10-5mol/L

圖4TH-BSA體系的紫外吸收光譜Fig.4UV spectra of TH-BSA systerm CTH=5×10-5mol/L;CBSA=0,0.2,0.4,0.8,1.0,1.2(10-6mol/L)

由圖4可見，TH在205nm處的吸收峰均有規(guī)律的降低且發(fā)生顯著紅移.說明TH與BSA形成了配合物.以上述波長處的吸收峰值考察BSA濃度對(duì)TH紫外吸收性質(zhì)的影響.作（A0-A）-1對(duì)[BSA]×10-5的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖，可得KA，結(jié)果見表4.2.6共存物質(zhì)的影響實(shí)驗(yàn)

在前面的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)常見的幾種生物體有機(jī)物質(zhì)和共存無機(jī)離子的干擾進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)定以相對(duì)誤差±5%左右為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算共存物質(zhì)存在的濃度，結(jié)果列于表5.表42種光譜法測(cè)得TH-BSA相互作用體系的結(jié)合常數(shù)、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)r Tab.4 Binding paraments,regression equations and correlation coefficient(r)of the interaction systerm studied by different methods

作用體系 方法 KA(L/mol) 線性回歸方程 相關(guān)系數(shù)r TH-BSA 3.9428×1045.3672×105FS UVS log（F0-F）/F=1.0655log[Q]+4.5958（A0-A）-1=1.5197[Q]-1+0.861 0.9979 0.9965表5 共存物質(zhì)的影響Tab.5 Influence of coexisting substances（CTH=1.0×10-5mol/L）

coexisting substances Cu2+Fe3+Pb2+Al3+Zn2+Ca2+Mg2+Ni2+DL-半光氨酸 檸檬酸 L-苯丙氨酸 DL-蘋果酸C共存(×10-5mol/L) 0.6 0.5 0.8 6.8 13.7 110 2400 1.8 3.65 860 15.6 820

結(jié)果表明：由于BSA可與許多金屬離子發(fā)生作用，各種金屬離子與BSA的結(jié)合部位不同，結(jié)合力也有差別.金屬離子的存在會(huì)影響TH與蛋白的結(jié)合能力，即影響TH與BSA的結(jié)合常數(shù).

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Study on the Interactions Between Theophylline and Bovine Serum Albumins by Fluorescence Spectroscopy

LI Gaixian1，LI Jianqing1*，WEI Yanli2
（1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Jingzhong College，Jingzhong030600，China；2.Environmental-science and Engineering-study center，Shanxi University，Taiyuan030006，China；）

The interactions between Theophylline and bovine serum albumin(BSA)were studied by fluorescence and UV absorption spectroscopy.The binding constants KA(1.96×104，3.80×104,1.57×105)and binding sites n(1.0,1.1,1.2)were measured at different temperatures of 10℃,28℃and 40℃.The results revealed that Theophylline has strong abili?ty to quench the intrinsic fluorescence of BSA and the interactions has been verified as static quenching procedure.Ac?cording themodynamic parameters the acting forces were determined to be hydrophobic force.

Theophylline；Bovine Serum Albumin；Fluorescence；Ultraviolet absorption spectures；Energy transfer

O 657.31

A

1674-4942（2010）04-0396-04

2010-05-30

國家自然科學(xué)基金(20875059)；山西省歸國留學(xué)人員基金(200809)

*通訊作者

畢和平