畢和平，周 賢，陳光英，辜燕飛

（海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，海南 ?？?571158）

苯酚-硫酸法測定破布葉葉的多糖

畢和平，周 賢，陳光英，辜燕飛

（海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，海南 ?？?571158）

對(duì)苯酚-硫酸法測定破布葉葉多糖含量的影響因素進(jìn)行了考察和優(yōu)化.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，測定波長為485 nm、苯酚用量1.4 mL、反應(yīng)溫度40℃、反應(yīng)時(shí)間15 min時(shí)，在10.0～70.0 g/mL范圍內(nèi)吸光度與多糖含量呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.9998.平均回收率99.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)1.16%（n=6）.

破布葉；多糖；苯酚-硫酸法

破布葉屬植物全世界約有60種，分布于非洲、印度、馬來西亞等地，在我國有2種，為破布葉和海南破布葉[1-2].破布葉（Microcos paniculataL.）又名薢寶葉；布渣葉等，主要分布于我國廣東、海南、廣西、云南等地.破布葉的葉用于清熱解毒,消食積.主治感冒、消化不良、腹脹、黃疸、蜈蚣咬傷、腹脹、黃疸、小兒盜汗、作茶飲去食積等[2].破布葉的藥用最早見于何克諫（清）所著的《生草藥性備要》,稱其味酸，性平，無毒，解一切蠱脹，清黃氣，消熱毒.作茶飲，去食積等[3-4].多糖是存在于自然界的醛糖和(或)酮糖通過糖苷鍵連接在一起的聚合物，具有多種藥理活性[5-8].多糖含量的測定方法主要有蒽酮硫酸法和苯酚-硫酸法.本文采用苯酚-硫酸比色法測定多糖含量，從方法學(xué)上考察了檢測波長、顯色溫度、顯色時(shí)間、顯色劑用量、線性范圍、精密度和測定穩(wěn)定性的影響.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

儀器：UV2600紫外可見分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；FZ-102型微型植物試樣粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-C型循環(huán)水式多用真空泵（河南省鞏義市英峪予華儀器廠）；FA1604型光電天平（上海精科天平廠）；索式提取器（自制）.

試劑：葡萄糖、苯酚、濃硫酸等均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?，所用水為蒸餾水.

材料：破布葉于2009年3月采集于海南省尖峰嶺國家森林保護(hù)區(qū)，經(jīng)海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鐘瓊心高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為Microcos paniculataL.的葉.自然晾干，粉碎備用.

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

參照文獻(xiàn)[9-10]的方法并作改進(jìn).精密稱取105℃干燥至恒重的D-無水葡萄糖0.1000 g，置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液.精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，分別置于50 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液.

精密稱取重蒸苯酚12.5 g，加適量水溶解后，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中定容至刻度，搖勻后置于棕色試劑瓶，得5%苯酚溶液，備用.

取不同濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和蒸餾水各2.0 mL，分別置于20 mL具塞試管中，分別加1.4 mL苯酚和濃硫酸7 mL，于沸水中加熱15 min，立即放入冷水中，水浴30 min保持40℃，用紫外-可見光分光光度計(jì)于485 nm波長下進(jìn)行測定.

1.3 破布葉的葉中粗多糖的提取與測定

稱取粉碎到20目的破布葉的葉2 g，加入約10倍的蒸餾水，80℃水浴回流提1 h.提取的含多糖溶液適當(dāng)濃縮后轉(zhuǎn)入250 mL三角瓶中，加適量蒸餾水后在沸水浴上溶解，冷卻后轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中定容至刻度并搖勻，即得樣品溶液，備用.分別精確吸取樣品溶液2.0 mL，余下部分按1.2節(jié)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定部分進(jìn)行操作,并隨行空白對(duì)照.

2 結(jié)果與討論

2.1 測量波長選擇

精確量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(40 μg/mL)和樣品溶液各2.0 mL，余下部分按1.2節(jié)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法操作.顯色后，在紫外-可見分光光度計(jì)上于400～600 nm波長范圍內(nèi)掃描.結(jié)果見圖1.可見標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液在485 nm處均有最大吸收，選擇485 nm為測定波長.

2.2 顯色溫度選擇

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液和樣品溶液各2.0 mL于試管中，依次加入苯酚液1.0 mL、濃硫酸7.0 mL，搖勻，分別在40、60、80和100℃下加熱15 min，取出立即放入冷水中，水浴30 min，然后取出，按照1.2項(xiàng)下方法用紫外-可見光分光光度進(jìn)行測定.試驗(yàn)證明，測量溫度為40℃為最佳顯色溫度.

2.3 顯色時(shí)間選擇

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試樣品溶液2.0 mL于試管中，依次加入苯酚液1.0 mL、濃硫酸7.0 mL，搖勻，分別加熱0、5、10、15、20、25和30 min，余下部分按1.2節(jié)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法操作,測定吸光度.由試驗(yàn)結(jié)果可知，加熱15 min后的標(biāo)準(zhǔn)液和供試樣品溶液的吸光度趨于平緩，選擇15 min為最佳顯色時(shí)間.

圖1 波長掃描曲線圖Fig.1Wavelength scanning curve

2.4 苯酚用量選擇

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試樣品溶液2.0 mL于試管中，分別加入苯酚液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 和2.0 mL，再加入濃硫酸7.0 mL，搖勻，余下部分按1.2節(jié)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法操作,測定吸光度.由試驗(yàn)結(jié)果可知，在1.4 mL苯酚用量下，標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試樣品溶液的吸光度都達(dá)到最高，所以選擇1.4 mL為苯酚最佳用量.

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

按1.2項(xiàng)進(jìn)行操作，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制吸光度-葡萄糖質(zhì)量濃度的關(guān)系曲線，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0136x－0.01408，相關(guān)系數(shù)r為0.9998.結(jié)果表明，葡萄糖在10～70 μg/mL范圍內(nèi)，其濃度與吸光度線性關(guān)系良好，見圖2.

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

吸取6份葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液2.0 mL，分別置具塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法，平行測定吸光度，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為0.55%（n=6）和0.61%（n=6），精密度良好。

2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密吸取供試樣品溶液1.0 mL 6份，各加入20.0、30.0、40.0、50.0、60.0和70.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液1.0 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法進(jìn)行測定吸光度，計(jì)算回收率[7].測定和計(jì)算結(jié)果見表1.平均回收率為99.16%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.16%（n=6）.

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2Standard curve

表1 加樣回收率試驗(yàn)Tab.1 Results of spike recovery test

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試樣品溶液各2 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法每隔一定時(shí)間測定吸光度.由試驗(yàn)可知，測定顯色溶液在120 min內(nèi)穩(wěn)定性良好.

3 結(jié)論

在苯酚-硫酸法中，測定破布葉葉多糖含量的最佳測定波長為485 nm，顯色的溫度為40℃，顯色時(shí)間為15 min，苯酚的加入量為1.4 mL，顯色液在120 min內(nèi)穩(wěn)定性好.多糖含量在10～70 μg/mL之間與吸光度成良好的線性關(guān)系，在最佳提取條件下，測得破布葉葉中的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.76%.此測定方法簡單靈敏，顯色穩(wěn)定，結(jié)果可靠.

[1]陳煥鏞.海南植物志(2卷)[M].北京:科學(xué)出版社,1977:58-59.

[2]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典(下冊(cè))[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2003:1824-1825.

[3]畢和平,韓長日,王芳,等.分光光度法測定破布葉中總黃酮[J].廣東化工,2006,33(155):43-44.

[4]畢和平,韓長日,梁振益,等.破布葉葉片中揮發(fā)油的化學(xué)成分研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2007,27(3):125-126.

[5]張懷,章琦,祁東利,等.柏子仁多糖含量測定及其改善睡眠作用研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010,12(9):25-27.

[6]李華為,趙素云,劉曉波,等.硒多糖的抗氧化活性及與過氧化氫酶協(xié)同作用的研究[J].分析化學(xué),2010,38(9):1256-1260.

[7]李明春,梁東升,許自明,等.靈芝多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)CAMP含量的影響[J].中國中藥雜志,2000,25(1):41-4.

[8]金春華,姜秀蓮,王英軍,等.靈芝多糖活血化瘀作用實(shí)驗(yàn)究[J].中草藥,1998,29(7):470-472.

[9]韓燕全,黃正明,楊新波,等.苯酚-硫酸法測定不同工藝六味地黃口服液中多糖的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2008,24(4):349-352.

[10]豐朝霞,張鴻.分光光度法測定茯苓中多糖總糖含量[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2000,11(2):109-110.

[11]任成忠,毛麗芬.加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的實(shí)施及回收率計(jì)算的研究[J].工業(yè)安全與環(huán)保,2006,32(2):9-11.

Study on Phenol-Sulfuric Acid Method for Determination of Polysaccharide Content in Leave of Microcos paniculata L.

BI Heping，ZHOU Xian，CHEN Guangying，GU Yanfei
（College of Chemistry and Chemical Engineering,Hainan Normal University,Haikou571158，China）

The factors affecting the determination of polysaccharide content in Paniculateicrocos eryngii with phe?nol-sulfuric acid method were optimized.Results showed that under the conditions of detection wavelength 485 nm,phe?nol content 1.4 mL,reactiontemperature 40℃and reaction time 15 min,there is good linearity range from 10.00 to 70.00μg/mL(r=0.9996).The average recovery is 99.2%and the RSD is 1.16%.

Microcos paniculata L；polysaccharide；phenol-sulfuric acid method

R 927.2

A

1674-4942（2010）04-0400-03

2010-09-25

海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20804）；海南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目；海南師范大學(xué)有機(jī)化學(xué)重點(diǎn)學(xué)科資助項(xiàng)目

黃 瀾