孟金蘭，蘭愛平，楊春濤，楊戰(zhàn)利，王立偉，陳麗新，朱琳燕，陳培熹，馮鑒強

近年的研究表明［1］，硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)作為一種新型的氣體信號分子，不僅具有神經(jīng)調(diào)質(zhì)的作用，而且也被視為一種重要的生理性保護成分，具有廣泛的生物學效應(yīng)。H2S不僅可保護鼠大腦皮層神經(jīng)元對抗氧化應(yīng)激的損傷［2］;亦具有抗神經(jīng)元凋亡的作用［3，4］。有趣的是，當小鼠吸入H2S后能降低體內(nèi)代謝約90%，然后進入“假死”狀態(tài)［5］，由此而保護小鼠對抗隨后致命的缺氧損傷［6］。但是H2S能否保護神經(jīng)細胞對抗化學性缺氧引起的損傷尚未明確。

熱休克蛋白(heat shock proteins，Hsp)是細胞受到各種理化因素刺激(包括缺氧)后誘導機體產(chǎn)生的一組保護性蛋白，包括Hsp90、Hsp70和Hsp40等。這些蛋白廣泛存在于生物界的原核及真核生物細胞中，參與調(diào)節(jié)其多種靶蛋白(包括存活和凋亡因子)的折疊和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定［7］。在缺氧條件下，Hsp90的表達上調(diào)可對抗心肌缺血/再灌注引起的損傷［8］。應(yīng)用Hsp90抑制劑抑制其表達可增加心肌的缺血/再灌注損傷［9］，然而，H2S抗化學性缺氧的神經(jīng)細胞保護作用是否與Hsp90信號通路有關(guān)，Hsp90在其中起何作用還不清楚。由此，本研究應(yīng)用CoCl2(一種化學性低氧模擬劑)損傷具有神經(jīng)元形態(tài)和功能特征的來源于大鼠嗜鉻細胞瘤的PC12細胞，以建立化學性缺氧誘導的神經(jīng)細胞損傷模型，擬探討H2S能否對抗CoCl2引起的PC12細胞損傷及Hsp90在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 NaHS、氯化鈷、17-丙烯胺基-17-去甲氧基格爾德霉素(17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin，17-AAG)、Hoechst 33258 購自美國 Sigma Aldrich公司，CCK-8試劑盒購自日本Dojindo Lab，DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司。PC12細胞由中山大學實驗動物中心提供。

1.2 細胞培養(yǎng) PC12細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 實驗分組 實驗分為6組:① 空白對照組(Control);② NaHS預(yù)處理組(PC):單獨應(yīng)用400 μmol·L－1NaHS處理PC12細胞3 h;③ CoCl2損傷組(CoCl2):應(yīng)用600 μmol·L－1CoCl2處理 PC12 細胞48 h;④ PC+CoCl2;⑤ 17-AAG+PC+CoCl2:在應(yīng)用 NaHS 前30 min，用2 μmol·L－1Hsp90 抑制劑17-AAG處理細胞30 min，其余的實驗步驟與④ 組相同;⑥ 單獨17-AAG 組(17-AAG):應(yīng)用2 μmol·L－117-AAG處理PC12細胞30 min。

1.4 細胞存活率的檢測 取對數(shù)生長期細胞，以1×104/孔接種于96孔板，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜后，更換為含有不同處理因素的培養(yǎng)基，每組設(shè)5個復(fù)孔。處理結(jié)束后各組細胞分別與CCK-8(每孔 100 μl加 10 μl CCK-8)37℃孵育 4 h，隨后在酶聯(lián)免疫檢測儀測定每孔的吸收值(λ=450 nm)，按公式:存活率(%)=實驗組OD/正常對照組OD×100%，求出實驗組的存活率，重復(fù)3次。

1.5 Hoechst 33258核染色法檢測細胞凋亡 把PC12細胞接種于24孔板內(nèi)，按實驗分組要求給不同的處理因素作用一定時間后，PBS洗兩次，加入新鮮配制的4%多聚甲醛，4℃固定10 min，PBS漂洗后，加入5 mg·L－1Hoechst 33258試劑，室溫輕搖10 min。在熒光顯微鏡(TE-2000，Nikon，Japan)下攝片，正常細胞核表現(xiàn)為彌漫均勻的低強度熒光，凋亡細胞核呈濃染致密固縮狀態(tài)或顆粒狀熒光。隨機選取視野在熒光顯微鏡下攝片。

1.6 PI染色流式細胞儀(FCM)檢測細胞凋亡細胞按實驗要求給以不同的因素處理后，離心收集細胞，PBS洗兩次，加入預(yù)冷的70%乙醇4℃固定過夜。用PBS洗兩遍，PI染色后，用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)DNA的含量(激發(fā)波長:488 nm;發(fā)射波長:610 nm)。每樣本計數(shù)12 000個細胞，以DNA組方圖中低于G1期DNA含量的亞G1峰的大小代表凋亡細胞數(shù)的多少。

1.7 Western blot法檢測Hsp90的表達 細胞按實驗分組給以不同的處理因素，離心收集。預(yù)冷的PBS洗滌兩次，加入裂解緩沖液，4℃靜置30 min。12 000×g離心10 min，取上清，采用BCA法進行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1.5 h。隨后加入Hsp90抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST洗3次，加入相應(yīng)的二抗，孵育1 h，漂洗3次。將PVDF膜用發(fā)光試劑ECL顯色后，用Image J 1.41o進行灰度分析，每樣本重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用ˉ±s表示，統(tǒng)計方法采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 H2S減弱CoCl2誘導的細胞毒性作用 本文在預(yù)實驗時證實600 μmol·L－1CoCl2能明顯地損傷 PC12 細胞，因此，本研究中應(yīng)用 600 μmol·L－1CoCl2作為CoCl2的有效損傷濃度。Fig 1顯示，600 μmol·L－1CoCl2作用 PC12 細胞 24 h，對細胞具有明顯的細胞毒性作用，使細胞存活率降低至(54.13±4.49)%，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。400 μmol·L－1NaHS 預(yù)處理 3 h 能對抗CoCl2的細胞毒性作用，使細胞存活率從(54.13±4.49)%提高至(79.42±3.29)%(P<0.01)。

Fig 1 Effects of different treatments on viability of PC12 cells(n=5)

2.2 H2S抑制CoCl2誘導的細胞凋亡作用 Fig 2的Hoechst 33258染色熒光顯微鏡照相術(shù)檢測的結(jié)果顯示，正常的PC12細胞呈現(xiàn)為散在的低強度熒光(Fig 2A)。凋亡細胞核則呈濃染致密的固縮狀態(tài)或顆粒狀熒光。600 μmol·L－1CoCl2作用 PC12細胞48 h，使凋亡細胞的數(shù)目明顯增多(Fig 2C)。400 μmol·L－1NaHS本身不引起細胞凋亡(Fig 2B)，但能保護PC12細胞對抗CoCl2的致凋亡作用，使凋亡細胞數(shù)量減少(Fig 2D)。與上述實驗結(jié)果相似，流式細胞檢測的結(jié)果(Fig 3)顯示，正常時，PC12細胞的凋亡數(shù)量很低，CoCl2卻使細胞凋亡率增加至(38.8 ±1.27)%;400 μmol·L－1NaHS 預(yù)處理能使CoCl2誘導的細胞凋亡率降低至(15.1±0.47)%(P<0.01)。

Fig 2 Morphological changes in apoptotic cells of differentgroups assessed by Hoechst 33258 staining

2.3 H2S預(yù)處理上調(diào)Hsp90的表達 給予PC12細胞 NaHS 預(yù)處理，觀察預(yù)處理后1、3、6、9、12 及 24 h Hsp90的表達情況。Western blot的檢測結(jié)果顯示，400 μmol·L－1NaHS預(yù)處理1 h ，可使 PC12 細胞Hsp90表達開始升高;在預(yù)處理3 h，Hsp90表達達到高峰，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，F(xiàn)ig 4);隨后，Hsp90的表達水平下降，作用24 h后，Hsp90表達恢復(fù)到對照水平，提示H2S預(yù)處理對Hsp90表達具有促進作用。

Fig 3 Effects of different treatments on apoptosis of PC12 cells(n=3)

Fig 4 Effects of H2S preconditioning onexpression of Hsp90 in different time(n=3)

值得注意的是 Fig 5顯示，CoCl2(600 μmol·L－1)也能上調(diào)Hsp90的表達，而且，H2S預(yù)處理能進一步增強CoCl2對PC12細胞Hsp90表達的上調(diào)作用，提示 H2S的細胞保護作用可能與其上調(diào)Hsp90有關(guān)。

Fig 5 17-AAG on Hsp90 expression(n=3)

2.4 Hsp90介導H2S抗CoCl2誘導的細胞損傷作用 為了探討Hsp90在H2S誘導的細胞保護中的作用，本文在NaHS預(yù)處理前30 min使用Hsp90抑制劑17-AAG(2 μmol·L－1)，觀察對 Hsp90 表達及NaHS預(yù)處理誘導的細胞保護作用的影響。

Fig 5的Western blot結(jié)果顯示，17-AAG可明顯抑制H2S誘導的Hsp90表達增高。同時，17-AAG可明顯拮抗H2S的細胞保護作用:在NaHS預(yù)處理前30 min加入2 μmol·L－117-AAG 后可使細胞存活率下降到(55.74±6.47)%(與H2S保護組相比，P<0.01，F(xiàn)ig 1);使細胞凋亡率再次回升到(34.5±0.48)%(與 H2S保護組相比，P<0.01，F(xiàn)ig 3);Hoechst 33258核染色形態(tài)學結(jié)果亦顯示，17-AAG增加了細胞凋亡，減弱了H2S的細胞保護作用(Fig 2)。

上述結(jié)果提示Hsp90介導了H2S抗CoCl2誘導的細胞損傷作用。

3 討論

最近，本實驗室證實，H2S預(yù)處理能對抗化學性缺氧引起的心肌損傷［10］。本文再次證實，H2S預(yù)處理能保護具有神經(jīng)元的形態(tài)和功能特征的PC12細胞對抗CoCl2引起的損傷作用。表明在不同的細胞模型，在體實驗或離體實驗，H2S均具有抗缺氧/缺血的細胞保護作用，這與曾因明課題組近期的研究結(jié)果相一致［11，12］。

新近研究表明，H2S能抑制缺血/再灌注引起的肝損傷，并增加Hsp90和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，提示H2S可通過上調(diào)Hsp90表達來保護肝細胞對抗缺血/再灌注損傷［13］。Hsp90是一種重要的細胞保護蛋白，可對抗包括缺氧/缺血等各種致死性的因素引起的細胞損傷［14］。研究表明，在心肌缺血區(qū)Hsp90高表達可保護心肌免受缺血/再灌注損傷;同時，過表達Hsp90也可抗心肌缺氧損傷［15］。

然而，Hsp90是否介導H2S抗化學性缺氧損傷的神經(jīng)保護作用，至今未見報道。為了揭示兩者的關(guān)系，本實驗觀察了400 μmol·L－1H2S供體NaHS作用PC12細胞不同時間對Hsp90表達的影響。本文發(fā)現(xiàn)，H2S預(yù)處理對PC12細胞Hsp90表達有明顯的上調(diào)作用。表明H2S是一種有效激活保護性蛋白Hsp90的物質(zhì)，這與 Jha等［13］的研究結(jié)果相一致。

為了進一步揭示Hsp90在H2S保護PC12細胞抗化學性缺氧損傷中的作用，本研究在NaHS預(yù)處理前30 min使用Hsp90抑制劑17-AAG。實驗結(jié)果表明，Hsp90抑制劑17-AAG在抑制Hsp90表達的同時，能明顯地阻斷H2S的細胞保護作用，使PC12細胞存活率降低及凋亡率增加，提示Hsp90介導H2S誘導的神經(jīng)保護作用，本實驗為深入闡明H2S的神經(jīng)細胞保護作用機制提供了新穎的實驗依據(jù)。

［1］ 蔡文杰，琚立華，朱依純.硫化氫的治療性應(yīng)用研究進展［J］.中國藥理學通報，2009，25(7):854 －6.

［1］ Cai W J，Ju L H，Zhu Y C.Research progress on hydrogen sulfide′s potential therapeutic use［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(7):854－6.

［2］ Kimura Y，Kimura H.Hydrogen sulfide protects neurons from oxidative stress［J］.Faseb J，2004，18(10):1165 － 7.

［3］ Hu L F，Lu M，Wu Z Y，et al.Hydrogen sulfide inhibits rotenoneinduced apoptosis via preservation of mitochondrial function［J］.Mol Pharmacol，2009，75(1):27 －34.

［4］ Tang X Q，Yang C T，Chen J，et al.Effect of hydrogen sulphide on beta-amyloid-induced damage in PC12 cells［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2008，35(2):180 －6.

［5］ Blackstone E，Morrison M，Roth M B.H2S induces a suspended animation-like state in mice［J］.Science，2005，308(5721):518.

［6］ Blackstone E，Roth M B.Suspended animation like state protects mice from lethal hypoxia［J］.Shock，2007，27(4):370 －2.

［7］ Terasawa K，Minami M，Minami Y.Constantly updated knowledge of Hsp90［J］.J Biochem，2005，137(4):443 －7.

［8］ Chen J X，Meyrick B.Hypoxia increases Hsp90 binding to eNOS via PI3K-Akt in porcine coronary artery endothelium［J］.Lab Invest，2004，84(2):182 －90.

［9］ Jiao J D，Garg V，Yang B，Hu K.Novel functional role of heat shock protein 90 in ATP-sensitive K+channel-mediated hypoxic preconditioning［J］.Cardiovasc Res，2008，77(1):126 － 33.

［10］廖新學，楊春濤，楊戰(zhàn)利，等.硫化氫對抗化學性缺氧引起的心肌細胞損傷及其機制［J］.中國藥理學通報，2009，25(8):1012－7.

［10］Liao X X，Yang C T，Yang Z L，et al.Hydrogen sulfide protects H9C2 cells against chemical hypoxia-induced injury and the underlying mechanisms［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(8):1012 －7.

［11］徐 鋼，季 永，汪 莉，等.內(nèi)源性硫化氫參與缺血后處理減輕離體大鼠心臟缺血/再灌注損傷［J］.中國藥理學通報，2008，24(7):910 －4.

［11］Xu G，Ji Y，Wang L，et al.Endogenous hydrogen sulfide participating in the ischemic postconditioning against cardiac ischemia/reperfusion injury［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(7):910 －4.

［12］汪 莉，徐 鋼，季 永，等.硫氫化鈉后處理對缺氧/復(fù)氧心肌細胞線粒體滲透性轉(zhuǎn)換的影響［J］.中國藥理學通報，2008，24(12):1610 －4.

［12］Wang L，Xu G，Ji Y，et al.The effect of NaHS postconditioning on mitochondrial permeable transition during hypoxia/reoxygenation in cultured rat myocardial cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(12):1610－4.

［13］Jha S，Calvert J W，Duranski M R，et al.Hydrogen sulfide attenuates hepatic ischemia/reperfusion injury:role of antioxidant and antiapoptotic signaling［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008，295(2):H801－6.

［14］馬 波，張建軍，劉耕陶.熱休克蛋白與神經(jīng)保護［J］.中國藥理學通報，2008，24(8):984 －7.

［14］Ma B，Zhang J J，Liu G T.Hsp70 and neuroprotection［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(8):984 － 7.

［15］Brar B K，Railson J，Stephanou A，et al.Urocortin increases the expression of heat shock protein 90 in rat cardiac myocytes in a MEK1/2-dependent manner［J］.J Endocrinol，2002，172(2):283－93.