曹 俊，鄒曉平，于成功，于紅剛

(1.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院消化內科，江蘇南京 210008;武漢大學人民醫(yī)院消化內科，湖北武漢 430060)

胃泌素是一種多肽類激素和營養(yǎng)因子，能促進上消化道黏膜生長。近年來，研究發(fā)現(xiàn)［1，2］胃泌素也具有促進大腸癌生長的作用，而且已在不同的細胞模型中證實了胃泌素的促增殖作用是通過與其受體(CCK-2R)結合進行調控的，并發(fā)現(xiàn)可增加腫瘤的侵襲和轉移。核轉錄因子(nuclear factor-κB，NF-κB)異?；罨芯勘砻髋c某些系統(tǒng)腫瘤的浸潤轉移密切相關。NF-κB可激活與浸潤轉移相關的某些重要因子的表達，進而發(fā)揮其在腫瘤進展中的重要作用［3］。尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，uPA)是一種絲氨酸蛋白酶，與其受體結合后激活纖溶酶原，轉化成纖溶酶，進而激活金屬蛋白酶等多種蛋白酶，參與腫瘤的侵襲、轉移等過程［4］。前期研究［5］發(fā)現(xiàn) NF-κB 在大腸癌組織中持續(xù)活化，本研究進一步研究胃泌素對大腸癌細胞NF-κB的活化及uPA表達的影響，了解胃泌素對人結腸癌的生物學效應和信號轉導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 結腸腺癌細胞株Colo320細胞購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。人胃泌素受體(gastrin receptor，GR)真核表達載體 pCR3.1/GR、真核表達空載體pCR3.1和胃泌素受體拮抗劑L365，260由德國波鴻大學St-Josef醫(yī)院分子消化研究室饋贈。胃泌素(Gastrin-17，G17，美國Sigma公司)，兔抗人多克隆抗 uPA和 ECL試劑盒(美國Santa Cluz公司)，兔抗人多克隆抗NF-κB p65(美國Cell Signaling Technology公司)，二硫氨基甲酸吡啶(PDTC，美國Sigma公司)，核蛋白提取試劑盒(美國 Active Motif公司)，Gel Shift Assay Systems試劑盒(美國Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人結腸腫瘤細胞系Colo320細胞用10%FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細胞轉染與篩選 見參考文獻［6］。簡言之，脂質體穩(wěn)定轉染pCR3.1/GR到Colo320細胞，用濃度500 mg·L－1G418篩選。篩選出的G418抗性克隆后，通過RT-PCR和免疫印跡鑒定CCK-2R(胃泌素受體)的表達，將陽性克隆命名為 Colo320WT。

1.2.3 實驗分組 分為對照組(C)、胃泌素組(G17)、胃泌素 +L365，260 組(G17+L365，260)及L365，260 組。胃泌素組用 10－8mol·L－1胃泌素干預Colo320WT細胞12 h，胃泌素加 L365，260組是應用 10－6mol·L－1胃泌素受體拮抗劑 L365，260 預干預 Colo320WT 細胞30 min，再加10－8mol·L－1胃泌素干預 12 h，L365，260 組是 10－8mol·L－1胃泌素受體拮抗劑 L365，260干預Colo320WT細胞30 min。

1.2.4 EMSA(電泳遷移率檢測) 按試劑盒說明書進行，簡言之，抽提細胞核蛋白，γ-32P標記NF-κB寡核苷酸探針 (5′-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3′)。DNA-核蛋白結合反應物進行非變性聚丙烯酸凝膠電泳，將凝膠置于Whatman3MM濾紙上，干膠，X線片放射自顯影。

1.2.5 免疫印跡 Bradford方法測定蛋白濃度。在分離膠/積層膠上進行十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別用抗uPA抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜，二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，ECL顯影。

1.2.6 逆轉錄-PCR 按照TRIzol試劑盒一步法提取總的RNA，按逆轉錄試劑盒說明逆轉錄合成第一條鏈cDNA，從每個樣品中取1μl用于PCR，擴增反應條件如下:95℃ 5 min，95℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72℃1 min為一個循環(huán)，共25個循環(huán);0.7%瓊脂糖凝膠電泳。引物及擴增產物大小如下:uPA引物:上游引物為 5′-GGGGAGCAGAGACACTAACGAC-3′，下游引物為 5′-AAGGAAGGGATAACTGGCCAAG-3′，產物片段大小為 350 bp;β-actin引物:上游引物為 5′-CGAGCGGGAAATCGTGCGTGACATTAAGGAGA-3′，下游引物為5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3′，產物大小為479 bp，均由上海生物工程公司合成。

1.2.7 激酶阻斷實驗 Colo320WT細胞先用100 mg·L－1的NK-κB特異抑制劑二硫氨基甲酸吡啶(PDTC)預處理30 min，然后再添加 10－8mol·L－1胃泌素干預12 h，提取細胞蛋白并通過免疫印跡測定uPA的表達。

2 結果

2.1 胃泌素對NF-κB p65活化的影響 胃泌素干預Colo320WT細胞后，抽提細胞核提取物并用EMSA測定NF-κB p65的活性，發(fā)現(xiàn)胃泌素干預后其活性較未干預前明顯增加，當用胃泌素拮抗劑L365，260阻斷后，活性又降低，見Fig 1。

Fig 1 Effect of gastrin-17 on NF-κB p65 activation in Colo320WT cellsC:Control;G17:gastrin17;L:L365，260

2.2 胃泌素對uPA蛋白表達的影響 胃泌素干預Colo320WT細胞后，發(fā)現(xiàn)uPA蛋白表達較未干預前上調。當用胃泌素拮抗劑L365，260阻斷后，表達則下降，見Fig 2。

Fig 2 Effect of gastrin-17 on expression of uPA protein in Colo320WT cells

2.3 胃泌素對uPA的mRNA表達的影響 胃泌素干預Colo320WT細胞后，通過RT-PCR檢查uPA的mRNA表達，結果發(fā)現(xiàn)uPA的mRNA明顯較未干預前增加，但當用L365，260阻斷后表達又明顯下降，見 Fig 3。

Fig 3 Effect of gastrin-17 on expression of uPA mRNA in Colo320WT cells

2.4 PDTC對uPA蛋白表達的影響 為了研究胃泌素是通過NF-κB而引起uPA表達增加，我們用NF-κB特異性阻滯劑PDTC預處理細胞，然后再用胃泌素干預，結果發(fā)現(xiàn)PDTC預處理后uPA的表達并沒有明顯上調，這說明了uPA的表達上調是通過NF-κB活化而引起的，見 Fig 4。

Fig 4 Effect of PDTC on expression of uPA

protein in Colo320WT cells by gastrin-17 stimulation

3 討論

胃泌素是一種多肽類激素和營養(yǎng)因子，近年來研究發(fā)現(xiàn)胃泌素不僅可以促進大腸癌的發(fā)展，而且可通過活化粘著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)通路促進大腸癌的侵襲和轉移［2，7］。NF-κB 在正常情況下存在于胞質與其抑制物IκBα結合。當細胞受到細菌或病毒感染、炎癥細胞因子等刺激時，IκBα將發(fā)生磷酸化并迅速降解，NF-κB就被釋放、激活并轉入細胞核內調控一系列的基因表達。研究表明NF-κB對于基質金屬蛋白酶9(MMP-9)、血管內皮生長因子(VEGF)等與腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移有調節(jié)作用。uPA是一種絲氨酸蛋白水解酶，參與腫瘤的的侵襲和轉移等過程。另研究表明作為NF-κB通路的下游分子uPA的啟動子區(qū)域包含有NF-κB結合位點，活化的NF-κB進入細胞核與uPA啟動子區(qū)域結合而上調其表達［8］。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，胃泌素干預Colo320WT細胞12 h后，對結腸癌細胞的侵襲和轉移達到最大效應，故本研究我們依然采用這個時間點來研究胃泌素對NF-κB通路的影響［2］。Colo320結腸癌細胞是低表達胃泌素受體CCK-2R，我們穩(wěn)定轉染了CCK-2R于Colo320細胞后構建高表達胃泌素受體的Colo320WT細胞。研究中用 10－8mol·L－1胃泌素干預結腸癌細胞Colo320WT后，應用EMSA檢查NF-κB活性，結果發(fā)現(xiàn)NF-κB活性較未干預時增加，但當用 10－6mol·L－1胃泌素拮抗劑 L365，260 預干預Colo320WT后，發(fā)現(xiàn)L365，260可阻斷胃泌素的效應，NF-κB活性沒有明顯增加，這充分說明了胃泌素可活化NF-κB。由于 uPA是NF-κB通路的下游分子，我們檢查了uPA的mRNA和蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)胃泌素可明顯上調uPA的表達。另一方面我們通過激酶阻斷實驗(即應用 NF-κB特異性拮抗劑PDTC)，發(fā)現(xiàn)了添加PDTC后，胃泌素并不能使 uPA的表達增加，這也說明了胃泌素上調uPA的表達是通過其活化NF-κB，繼而引起uPA轉錄和翻譯水平的增加。

總之，本研究證明了胃泌素與其受體CCK-2R結合后，活化了結腸癌細胞Colo320WT中NF-κB通路，上調uPA的表達，參與結腸癌的發(fā)生發(fā)展，為我們進一步提供了防治腫瘤的新思路。

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