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        肉蓯蓉提取物對敗血癥大鼠急性肺損傷的影響

        2010-12-03 08:53:28王貴林余萬桂
        中國中醫(yī)急癥 2010年3期
        關鍵詞:組肺肉蓯蓉敗血癥

        尹 剛 王貴林 余萬桂

        長江大學醫(yī)學院(荊州 434023)

        敗血癥是臨床急危重癥,尋求有效治療藥物一直是臨床和基礎研究的重大難題。敗血癥的中醫(yī)病機是正虛邪實,單純針對機體邪盛采取的攻下療法是有效治療措施之一,但僅局限于攻下治療也難免失之偏頗,重視扶正補虛治療同等重要。肉蓯蓉是傳統(tǒng)補益類中藥,藥理研究證實其具有增強細胞DNA合成率、抗氧自由基等保護功能。筆者實驗觀察肉蓯蓉對敗血癥肺組織損傷的作用,以求為敗血癥扶正補虛治療提供有效探索。

        1 材料與方法

        1.1 動物 健康雄性SD大鼠40只,體質量200~250g,由華中科技大學實驗動物中心提供,質檢號:TJLA—2008—167。隨機分為3組:生理鹽水組8只,1g/mL肉蓯蓉組12只,5g/mL肉蓯蓉組12只。實驗動物分別采用相應藥物常規(guī)灌胃15d,每日2次 (肉蓯蓉提取物由本院中藥制劑室提供),給藥劑量200mg/kg。實驗動物均按文獻[1]方法在盲腸結扎穿孔后12min采集標本。

        1.2 大鼠肺組織學檢查 每組取動物肺左葉少許,經10%甲醛固定,石蠟包埋切片,HE染色后,用普通光學顯微鏡觀察,并在此基礎上取肺組織制成1mm3用25%戊二醛溶液固定,然后固定于1%四氧化鋨液中,乙醇、丙酮脫水,經Epon 81包埋,制備超薄切片后,行鈾-鉛雙重染色,用透射電鏡觀察。

        1.3 大鼠肺組織濕/干重比、肺泡灌洗液中細胞計數(shù)比及蛋白含量測定 開胸取出肺臟,稱濕重后置烤箱 (80℃)烤至衡重,稱干重,計算濕/干重比。另一批大鼠開胸后行肺泡灌洗,灌洗液在顯微鏡下行細胞計數(shù)、細胞分類??捡R氏亮藍法測定蛋白含量,計算肺通透指數(shù) (肺泡灌洗液蛋白/血漿蛋白,LPI)。

        1.4 大鼠肺血管通透性(PVP)變化 按照Zhou等[2]介紹的方法,在給藥后,各組動物均在作盲腸結扎穿孔術同時股靜脈注射伊藍50mg/kg。開胸取出肺臟,剪去周圍組織,將肺浸泡在甲酰胺溶液中(甲酰胺用量按20mg/100g體質量),置45~50℃溫箱中溫育72h,待組織中色素全部浸出,取出組織,離心,取上清液,用紫外分光光度計于620nm處進行比色,根據標準曲線計算伊藍含量來測定PVP的變化。

        1.5 大鼠肺組織丙二醛 (MDA)的測定 采用硫代巴比妥酸(TBA)法[3]測定MDA活性。50mL待測標本加4mL 1.67mol/L的硫酸、0.541%磷鎢酸,混勻,3000r/min離心10min,沉淀再同上處理1次,然后加1mL雙蒸水、1mL TBA溶液,95℃水浴60min,用5mL正丁醇提取,四乙氧基丙烷作為標準品,終濃度為1nmol/L,熒光分光度計于532nm處測定吸光值。

        1.6 大鼠肺組織超氧化物歧化酶(SOD)的測定 按文獻[4]方法,采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性 (試劑盒購自南京建成生物工程研究所)。

        1.7 大鼠肺組織髓過氧化物酶 (MPO)測定 取肺組織于等滲鹽水中盡量洗凈殘血,置于含0.5%十六烷基三甲基溴化銨的磷酸緩沖液(pH6.0)中制成5%的勻漿,按試劑盒說明書操作。

        2 結果

        2.1 各組肺組織濕/干重比及肺泡灌洗液中細胞計數(shù)比、蛋白含量比較 見表1。生理鹽水組肺濕/干重比顯著高于肉蓯蓉組(P<0.05或0.01),肉蓯蓉組肺泡灌洗液中細胞計數(shù)比、蛋白含量明顯低于生理鹽水組(P<0.05或0.01),且隨著給藥質量濃度增加呈現(xiàn)顯著降低。

        表1 各組大鼠肺組織濕/干重比及肺泡灌洗液中細胞計數(shù)比、蛋白含量的比較 ()

        表1 各組大鼠肺組織濕/干重比及肺泡灌洗液中細胞計數(shù)比、蛋白含量的比較 ()

        與生理鹽水組比較,*P<0.01**P<0.01。下同

        組 別生理鹽水組1g/mL肉蓯蓉組5g/mL肉蓯蓉組肺組織濕/干重比4.58±0.20 4.28±0.21*4.17±0.16**細胞計數(shù)比(%)55.21±10.24 31.34±12.46*27.32±8.28**蛋白含量(mg/L)254.88±95.42 62.23±18.96*46.16±11.34**

        2.2 各組大鼠肺組織形態(tài)學改變的比較 大體觀察:生理鹽水組肺臟體積明顯增大,呈暗紅色,表面可見不同程度充血水腫,邊緣部分大量肺梗死灶;肉蓯蓉組肺臟呈淺紅色,表面輕度充血水腫,未見明顯肺梗死灶。光鏡觀察示,生理鹽水組見肺泡、肺間質充血水腫,肺泡腔內大量彌漫性中性粒細胞浸潤,部分有膿腫形成,可見不同程度的肺不張、壞死、代償性肺氣腫、血栓及類似透明膜形成。肉蓯蓉組上述病變明顯減輕。生理鹽水組肺泡上皮細胞腫脹,板層小體排空現(xiàn)象明顯,形成大空泡,毛細血管內皮細胞腫脹,內皮細胞之間連續(xù)損傷,細胞間隙增寬,毛細血管及肺泡基底膜疏松,增寬,不規(guī)則增厚,厚薄不均。肉蓯蓉組肺泡上皮細胞腫脹不明顯,板層小體排空減輕,形成空泡數(shù)量少,體積小,毛細血管內皮細胞之間連接接近正常,基底膜輕度疏松,不規(guī)則增厚。5g/mL肉蓯蓉組較1g/mL肉蓯蓉組肺組織形態(tài)學改變范圍更小,肺損傷程度更輕。

        2.3 各組大鼠LPI和PVP的比較 見表2。生理鹽水組LPI和PVP明顯高于肉蓯蓉組 (P<0.05或0.01),肉蓯蓉組LPI和PVP降低,具有顯著量效關系。

        2.4 各組大鼠肺組織MDA、SOD、MPO活性的比較 見表3。生理鹽水組肺組織中MDA含量顯著高于肉蓯蓉組,而肉蓯蓉組肺組織中SOD活性和MPO活性顯著增高(P<0.05或0.01)。

        表2 各組大鼠LPI和PVP比較 ()

        表2 各組大鼠LPI和PVP比較 ()

        組 別生理鹽水組1g/mL肉蓯蓉組5g/mL肉蓯蓉組LPI(×10-3)5.58±1.12 2.53±0.37*1.86±0.21**PVP(mg/L)6.54±0.86 3.87±0.72*3.04±0.40**

        表3 各組大鼠肺組織MDA、SOD、MPO活性比較 ()

        表3 各組大鼠肺組織MDA、SOD、MPO活性比較 ()

        組 別生理鹽水組1g/mL肉蓯蓉組5g/mL肉蓯蓉組MDA(nmol/mg)3.66±0.63 1.55±0.44*0.55±0.15**SOD(NU/mg)78.15±10.99 89.60±5.63*102.39±3.32**MPO(U/g)1.55±0.32 0.48±0.13*0.33±0.12**

        3 討論

        多器官衰竭是敗血癥后期病情不可逆轉和死亡率高的根本原因[5],保護器官功能對降低敗血癥臨床高死亡率具有重要意義。肺作為多器官衰竭的首發(fā)器官,1/3敗血癥患者死于急性肺損傷(ALI)和急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)。ALI的主要病理生理機制是大量中性粒細胞在肺組織內聚集和活化,并與血管內皮細胞黏附的同時,轉移單電子的還原型輔酶Ⅱ氧化酶濃度增高而引起呼吸爆發(fā),產生大量氧自由基,通過較強的氧化作用引起細胞膜和膜性結構的損害和功能障礙[6]。脂質過氧化物反映組織中氧自由基的變化,與肺損傷的程度有直接的量相關[7]。在機體的酶與非酶抗自由基氧化系統(tǒng)中,SOD的活性與組織損傷度保持良好的相關性[7]。肉蓯蓉組MDA和SOD活性與生理鹽水組比較,差異有統(tǒng)計學意義。肉蓯蓉具有增強免疫功能,抗衰老,增強細胞DNA合成率等作用。實驗結果表明,肉蓯蓉組肺系數(shù)、PLT、肺泡灌洗液中性粒細胞比例,肺血管通透性均顯著下降,肺組織MDA活性下降、SOD顯著上升,MPO活性下降。同時形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)肺組織損傷程度明顯減輕,中性粒細胞浸潤減少,且5g/mL肉蓯蓉組較1g/mL肉蓯蓉組肺損傷程度更輕,存在良好的量效關系。提示肉蓯蓉對ALI具有較顯著的保護作用。其機制可能為:(1)抑制炎性細胞肺內遷移,減少中性粒細胞等被激活產生的氧自由基,使生物膜得到保護;(2)促進核酸和蛋白質合成,對肺損傷具有保護作用;(3)增強吞噬細胞免疫功能,減輕內毒素造成的肺組織損傷。該實驗結果為臨床敗血癥急性肺損傷扶正補虛治療提供了實驗基礎。

        [1]金惠銘.盲腸結扎穿孔術后的敗血癥模型 [J].中國病理生理雜志,1990,6(2):126 ~ 127.

        [2]Zhou WG,Mc Collum MO,Levine BA,et al.Role of platelet activating factor in paneretltis associated acute lung injury in the rat[J].Am J Pathol,1992,140:971 ~ 979.

        [3]汪謙,朱曉峰,趙西龍.現(xiàn)代醫(yī)學實驗方法 [M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2007:508.

        [4]張秀明,李健齋,魏明竟.現(xiàn)代臨床生化檢驗學 [M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2008:896.

        [5]羅正曜.休克學[M].天津 :天津科學技術出版社,2008:345.

        [6]Manthous CA,Hall JB.Samsel RW.Endotoxin in humm disease,part 2Biologic effect and clinical evaluation of anti-endotoxln theries[J]Chest,2003,104:1872.

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