尹 剛 王貴林 余萬(wàn)桂

長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院(荊州 434023）

敗血癥是臨床急危重癥，尋求有效治療藥物一直是臨床和基礎(chǔ)研究的重大難題。敗血癥的中醫(yī)病機(jī)是正虛邪實(shí)，單純針對(duì)機(jī)體邪盛采取的攻下療法是有效治療措施之一，但僅局限于攻下治療也難免失之偏頗，重視扶正補(bǔ)虛治療同等重要。肉蓯蓉是傳統(tǒng)補(bǔ)益類中藥，藥理研究證實(shí)其具有增強(qiáng)細(xì)胞DNA合成率、抗氧自由基等保護(hù)功能。筆者實(shí)驗(yàn)觀察肉蓯蓉對(duì)敗血癥肺組織損傷的作用，以求為敗血癥扶正補(bǔ)虛治療提供有效探索。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量200～250g，由華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，質(zhì)檢號(hào)：TJLA—2008—167。隨機(jī)分為3組：生理鹽水組8只，1g/mL肉蓯蓉組12只，5g/mL肉蓯蓉組12只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別采用相應(yīng)藥物常規(guī)灌胃15d，每日2次 (肉蓯蓉提取物由本院中藥制劑室提供），給藥劑量200mg/kg。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均按文獻(xiàn)[1]方法在盲腸結(jié)扎穿孔后12min采集標(biāo)本。

1.2 大鼠肺組織學(xué)檢查 每組取動(dòng)物肺左葉少許，經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色后，用普通光學(xué)顯微鏡觀察，并在此基礎(chǔ)上取肺組織制成1mm3用25%戊二醛溶液固定，然后固定于1%四氧化鋨液中，乙醇、丙酮脫水，經(jīng)Epon 81包埋，制備超薄切片后，行鈾－鉛雙重染色，用透射電鏡觀察。

1.3 大鼠肺組織濕/干重比、肺泡灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)比及蛋白含量測(cè)定 開胸取出肺臟，稱濕重后置烤箱 (80℃）烤至衡重，稱干重，計(jì)算濕/干重比。另一批大鼠開胸后行肺泡灌洗，灌洗液在顯微鏡下行細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞分類?？捡R氏亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量，計(jì)算肺通透指數(shù) (肺泡灌洗液蛋白/血漿蛋白，LPI）。

1.4 大鼠肺血管通透性(PVP）變化 按照Z(yǔ)hou等[2]介紹的方法，在給藥后，各組動(dòng)物均在作盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)同時(shí)股靜脈注射伊藍(lán)50mg/kg。開胸取出肺臟，剪去周圍組織，將肺浸泡在甲酰胺溶液中(甲酰胺用量按20mg/100g體質(zhì)量），置45～50℃溫箱中溫育72h，待組織中色素全部浸出，取出組織，離心，取上清液，用紫外分光光度計(jì)于620nm處進(jìn)行比色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算伊藍(lán)含量來(lái)測(cè)定PVP的變化。

1.5 大鼠肺組織丙二醛 (MDA）的測(cè)定 采用硫代巴比妥酸(TBA）法[3]測(cè)定MDA活性。50mL待測(cè)標(biāo)本加4mL 1.67mol/L的硫酸、0.541%磷鎢酸，混勻，3000r/min離心10min，沉淀再同上處理1次，然后加1mL雙蒸水、1mL TBA溶液，95℃水浴60min，用5mL正丁醇提取，四乙氧基丙烷作為標(biāo)準(zhǔn)品，終濃度為1nmol/L，熒光分光度計(jì)于532nm處測(cè)定吸光值。

1.6 大鼠肺組織超氧化物歧化酶(SOD）的測(cè)定 按文獻(xiàn)[4]方法，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性 (試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所）。

1.7 大鼠肺組織髓過(guò)氧化物酶 (MPO）測(cè)定 取肺組織于等滲鹽水中盡量洗凈殘血，置于含0.5%十六烷基三甲基溴化銨的磷酸緩沖液(pH6.0）中制成5%的勻漿，按試劑盒說(shuō)明書操作。

2 結(jié)果

2.1 各組肺組織濕/干重比及肺泡灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)比、蛋白含量比較 見(jiàn)表1。生理鹽水組肺濕/干重比顯著高于肉蓯蓉組(P＜0.05或0.01），肉蓯蓉組肺泡灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)比、蛋白含量明顯低于生理鹽水組(P＜0.05或0.01），且隨著給藥質(zhì)量濃度增加呈現(xiàn)顯著降低。

表1 各組大鼠肺組織濕/干重比及肺泡灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)比、蛋白含量的比較 (）

表1 各組大鼠肺組織濕/干重比及肺泡灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)比、蛋白含量的比較 (）

與生理鹽水組比較，*P＜0.01**P＜0.01。下同

組 別生理鹽水組1g/mL肉蓯蓉組5g/mL肉蓯蓉組肺組織濕/干重比4.58±0.20 4.28±0.21*4.17±0.16**細(xì)胞計(jì)數(shù)比（%）55.21±10.24 31.34±12.46*27.32±8.28**蛋白含量(mg/L）254.88±95.42 62.23±18.96*46.16±11.34**

2.2 各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)改變的比較 大體觀察：生理鹽水組肺臟體積明顯增大，呈暗紅色，表面可見(jiàn)不同程度充血水腫，邊緣部分大量肺梗死灶；肉蓯蓉組肺臟呈淺紅色，表面輕度充血水腫，未見(jiàn)明顯肺梗死灶。光鏡觀察示，生理鹽水組見(jiàn)肺泡、肺間質(zhì)充血水腫，肺泡腔內(nèi)大量彌漫性中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，部分有膿腫形成，可見(jiàn)不同程度的肺不張、壞死、代償性肺氣腫、血栓及類似透明膜形成。肉蓯蓉組上述病變明顯減輕。生理鹽水組肺泡上皮細(xì)胞腫脹，板層小體排空現(xiàn)象明顯，形成大空泡，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，內(nèi)皮細(xì)胞之間連續(xù)損傷，細(xì)胞間隙增寬，毛細(xì)血管及肺泡基底膜疏松，增寬，不規(guī)則增厚，厚薄不均。肉蓯蓉組肺泡上皮細(xì)胞腫脹不明顯，板層小體排空減輕，形成空泡數(shù)量少，體積小，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞之間連接接近正常，基底膜輕度疏松，不規(guī)則增厚。5g/mL肉蓯蓉組較1g/mL肉蓯蓉組肺組織形態(tài)學(xué)改變范圍更小，肺損傷程度更輕。

2.3 各組大鼠LPI和PVP的比較 見(jiàn)表2。生理鹽水組LPI和PVP明顯高于肉蓯蓉組 (P＜0.05或0.01），肉蓯蓉組LPI和PVP降低，具有顯著量效關(guān)系。

2.4 各組大鼠肺組織MDA、SOD、MPO活性的比較 見(jiàn)表3。生理鹽水組肺組織中MDA含量顯著高于肉蓯蓉組，而肉蓯蓉組肺組織中SOD活性和MPO活性顯著增高(P＜0.05或0.01）。

表2 各組大鼠LPI和PVP比較 (）

表2 各組大鼠LPI和PVP比較 (）

組 別生理鹽水組1g/mL肉蓯蓉組5g/mL肉蓯蓉組LPI(×10－3）5.58±1.12 2.53±0.37*1.86±0.21**PVP（mg/L）6.54±0.86 3.87±0.72*3.04±0.40**

表3 各組大鼠肺組織MDA、SOD、MPO活性比較 (）

表3 各組大鼠肺組織MDA、SOD、MPO活性比較 (）

組 別生理鹽水組1g/mL肉蓯蓉組5g/mL肉蓯蓉組MDA(nmol/mg）3.66±0.63 1.55±0.44*0.55±0.15**SOD(NU/mg）78.15±10.99 89.60±5.63*102.39±3.32**MPO(U/g）1.55±0.32 0.48±0.13*0.33±0.12**

3 討論

多器官衰竭是敗血癥后期病情不可逆轉(zhuǎn)和死亡率高的根本原因[5]，保護(hù)器官功能對(duì)降低敗血癥臨床高死亡率具有重要意義。肺作為多器官衰竭的首發(fā)器官，1/3敗血癥患者死于急性肺損傷(ALI）和急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS）。ALI的主要病理生理機(jī)制是大量中性粒細(xì)胞在肺組織內(nèi)聚集和活化，并與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附的同時(shí)，轉(zhuǎn)移單電子的還原型輔酶Ⅱ氧化酶濃度增高而引起呼吸爆發(fā)，產(chǎn)生大量氧自由基，通過(guò)較強(qiáng)的氧化作用引起細(xì)胞膜和膜性結(jié)構(gòu)的損害和功能障礙[6]。脂質(zhì)過(guò)氧化物反映組織中氧自由基的變化，與肺損傷的程度有直接的量相關(guān)[7]。在機(jī)體的酶與非酶抗自由基氧化系統(tǒng)中，SOD的活性與組織損傷度保持良好的相關(guān)性[7]。肉蓯蓉組MDA和SOD活性與生理鹽水組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肉蓯蓉具有增強(qiáng)免疫功能，抗衰老，增強(qiáng)細(xì)胞DNA合成率等作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肉蓯蓉組肺系數(shù)、PLT、肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞比例，肺血管通透性均顯著下降，肺組織MDA活性下降、SOD顯著上升，MPO活性下降。同時(shí)形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)肺組織損傷程度明顯減輕，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少，且5g/mL肉蓯蓉組較1g/mL肉蓯蓉組肺損傷程度更輕，存在良好的量效關(guān)系。提示肉蓯蓉對(duì)ALI具有較顯著的保護(hù)作用。其機(jī)制可能為：（1）抑制炎性細(xì)胞肺內(nèi)遷移，減少中性粒細(xì)胞等被激活產(chǎn)生的氧自由基，使生物膜得到保護(hù)；（2）促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)合成，對(duì)肺損傷具有保護(hù)作用；（3）增強(qiáng)吞噬細(xì)胞免疫功能，減輕內(nèi)毒素造成的肺組織損傷。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為臨床敗血癥急性肺損傷扶正補(bǔ)虛治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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