荊 晶,陸小丹,周旭美
(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,貴州 遵義563003)
大黃為蓼科植物掌葉大黃(Rhrum palmatum L.)、唐古特大黃(Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.)或藥用大黃(Rheum officinale Baill.)的干燥根及根莖[1]。具有瀉下攻積、清熱瀉火、止血、解毒、活血化瘀之功效。大黃中的主要藥效成分為蒽醌類衍生物如大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃酸等[2]。清胰Ⅱ號(hào)是由大黃、梔子、赤芍、丹皮等中藥研制的復(fù)方制劑。具有清熱涼血、理氣開郁、活血止痛、通理攻下的作用,用于治療急性胰腺炎已有三十多年的臨床經(jīng)驗(yàn)[3]。經(jīng)近上千多例急性胰腺炎,近上百例重癥急性胰腺炎(SPA)的治療、總結(jié),收到較好的療效,SPA的治愈率顯著上升,達(dá)到國(guó)內(nèi)領(lǐng)先水平。
1.1 藥品試劑 大黃素對(duì)照品(含量測(cè)定用,批號(hào)∶110756-200110中國(guó)藥品生物制品檢定所),乙腈(色譜純,上海星可生化有限公司),乙醇(分析純,成都市科龍化工試劑廠),冰醋酸(分析純,成都市科龍化工試劑廠),甲醇(色譜純,上海星可生化有限公司),高純水。
1.2 儀器 美國(guó)Agilent 1100高效液相色譜儀,包括紫外檢測(cè)器和色譜工作站。Agilent Eclipse XDB C-18(150×4.6mm,0.46μm) 色譜柱。塞多利斯BT125D電子天平(北京塞多利斯科學(xué)儀器有限公司)。
1.3 色譜條件 色譜柱:Agilent Eclipse XDB C-18(150×4.6mm,0.46μm)。以乙腈-0.1%冰醋酸溶液(50∶50)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm,流速1.0ml/min,柱溫為30℃,進(jìn)樣量20μl[4]。
1.4 溶液制備
1.4.1 對(duì)照品溶液的制備 稱取大黃素標(biāo)準(zhǔn)品0.6mg,置于25ml的容量瓶中,用甲醇溶解并定容至25ml,配成 0.024mg/ml的大黃素標(biāo)準(zhǔn)液,置于 4℃冰箱中保存。
1.4.2 清胰Ⅱ號(hào)供試品溶液的制備 按照清胰Ⅱ號(hào)的配方稱取原料[5],將原料放在煎煮鍋里進(jìn)行煎煮(大黃、芒硝除外)。煮前快速浸泡5min左右,放干水,次日加入適量的水煎煮20min后,將已浸洗的大黃放入鍋中,再酌加適量的水繼續(xù)煎煮10min,藥液放出過(guò)濾,藥渣加入適量的水繼續(xù)煎煮,每次30分鐘。藥液過(guò)濾合并。將藥液進(jìn)行濃縮,用部分藥液將芒硝溶解,合并藥液,加入適量的苯甲酸鈉至藥液中,使至規(guī)定體積500 ml,使最后藥液中苯甲酸鈉的濃度為1.5%,攪拌均勻,備用。
1.4.3 清胰Ⅱ號(hào)對(duì)照品溶液的制備 不加入大黃,按照清胰Ⅱ號(hào)供試品溶液的制備方法操作,其他步驟均相同,制得大黃的陰性對(duì)照品溶液,備用。
2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 根據(jù)2005年版《中國(guó)藥典》第一部附錄ⅤA的紫外可見分光光度法,掃描大黃素的最大吸收波長(zhǎng),掃描范圍200~600nm,大黃素的最大吸收波長(zhǎng)為254nm,與大黃藥材含量測(cè)定項(xiàng)下的測(cè)定波長(zhǎng)相一致,確定大黃素的測(cè)定波長(zhǎng)為254nm。結(jié)果見圖1。
圖1 大黃素光譜掃描曲線Fig 1 UVscanning of Emodin
2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 以乙腈-0.1%冰醋酸溶液(50∶50)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為 254nm,流速 1.0ml/min,柱溫為30℃,進(jìn)樣量20μl此條件下對(duì)照品、供試品在約12min時(shí)間均有一色譜峰,陰性對(duì)照品無(wú)干擾。見色譜圖2。
圖2 大黃素高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram s of Emodin
2.3 線性關(guān)系的考察 采用大黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶液制得一系列梯度溶液,其濃度分別為1.2μg/ml、2.4μg/ml、4.8μg/ml、7.2μg/ml、9.6μg/ml、12.0μg/m l。按
2.2 色譜條件進(jìn)樣20μl,測(cè)定大黃素對(duì)照品的峰面積,將濃度與峰面積進(jìn)行線性回歸處理,得出回歸方程為:Y=72.638X+31.042,r=0.9999,大黃素對(duì)照品在1.2μg/m l~12.0μg/ml范圍內(nèi)樣品濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。
2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取大黃素對(duì)照品溶液(濃度為4.8μg/ml)20μl,按上述色譜條件,重復(fù)進(jìn)樣6次,每次20μl,測(cè)定對(duì)照品中大黃素峰面積值,計(jì)算峰面積值的RSD為1.12%。說(shuō)明儀器精密度良好。
2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取大黃素供試品溶液20μl,按上述色譜條件,每隔兩小時(shí),測(cè)定供試品溶液中大黃素峰面積值,計(jì)算供試品大黃素峰面積值的RSD為1.72%。說(shuō)明供試品在10h內(nèi)穩(wěn)定。
2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取清胰Ⅱ號(hào)水提法提取液,稱取10.00g,共6份,置于25ml容量瓶中,用甲醇定容并超聲30min[6],按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定結(jié)果經(jīng)數(shù)據(jù)處理,平均含量14.137μg/g,RSD為0.29%。
2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取本品(批號(hào))共9份,每份重約5.00g,置于25ml容量瓶中,分別精密加入大黃素對(duì)照品溶液(7.2μg/ml)8ml、10ml、12ml。余下的量用甲醇補(bǔ)足,然后超聲30min,冷卻后,吸取20μl,測(cè)定峰面積計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。
表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.8 大黃素含量測(cè)定 按照前文所述的方法和條件測(cè)試六批樣品,并計(jì)算其含量。結(jié)果如表2。
表2 大黃素含量測(cè)定
本次實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)大黃素相關(guān)制劑清胰Ⅱ號(hào)湯劑中大黃素進(jìn)行含量測(cè)定,與其他方法相比,具有操作簡(jiǎn)便,準(zhǔn)確性好,靈敏度高,重現(xiàn)性好的特點(diǎn),在制訂大黃相關(guān)重要制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí),可以使用大黃素含量作為指標(biāo)。
[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典Ⅰ部[S].化學(xué)工業(yè)出版社,2005.17.
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