陳 濤，王榮旋，蔣科會(huì)

（遵義醫(yī)院，貴州 遵義 563002）

聲門(mén)上型喉癌早期癥狀不典型，僅有咽部異物感，感覺(jué)咽部食物吞咽不凈，癥狀輕微，容易誤診。大部分病人來(lái)就時(shí)已屬中晚期，預(yù)后較聲門(mén)型喉癌差，需行部分喉切除或喉全切除術(shù)，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，因此聲門(mén)上型喉癌早期診斷顯得尤為重要。本研究擬應(yīng)用表面加強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)及其配套的蛋白質(zhì)芯片對(duì)聲門(mén)上型喉鱗癌患者和正常對(duì)照者血清中的蛋白質(zhì)組圖譜進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合相關(guān)軟件建立決策分類樹(shù)診斷模型，提高早期診斷率。

1 臨床資料

1.1 臨床資料與標(biāo)本來(lái)源 選擇2005年1月1日至2009年12月31日間，在遵義醫(yī)院住院首次治療的聲門(mén)上型喉鱗癌患者30例，其中男24例，女6例，年齡為42～78歲，中位年齡62歲，臨床病例資料完整，入院第二天晨起抽血，2小時(shí)內(nèi)提取血清無(wú)溶血者，血清提取后即入-80℃保存。對(duì)照組選用同期本院職工體檢健康者血清標(biāo)本30例，作為正常對(duì)照組，年齡為40～83歲，中位年齡60歲。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 血清標(biāo)本收集：清晨空腹采取全血標(biāo)本，常溫下放置2h，待自然凝固后，4℃1000 r/min離心30 min，取上層血清EP管分裝后立刻置血清標(biāo)本庫(kù)-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

血清樣品預(yù)處理：取出-70℃保存血清，0℃冰浴中溶解，4℃10000 r/min離心2min，取5μl血清樣品，加入 8mmol/L 尿素 10μl，4℃振蕩 30min，吸取上清用于蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)。

SELDI操作流程：在CM10蛋白質(zhì)芯片8個(gè)點(diǎn)（A-H點(diǎn)）的表面分別加10mM HCl 10uL，在濕盒內(nèi)放置10min后，吸去剩余的HCl，用去離子水洗芯片3次。將芯片安裝于生物處理器上。芯片A～H各點(diǎn)用200ul結(jié)合緩沖液（100mM NaAc乙酸鈉，pH4.0）預(yù)處理2次，每次室溫下振蕩孵育5分鐘。然后每點(diǎn)交叉滴加100ul已處理的聲門(mén)上型喉鱗癌或正常對(duì)照血清樣品，室溫振蕩孵育60min。棄掉表面樣品，各點(diǎn)用200 ul結(jié)合緩沖液洗滌3次，每次5min。最后各點(diǎn)再用1mM HEPES（pH 7.0）200ul迅速洗滌一次。卸去生物處理器，待芯片表面自然晾干后，各點(diǎn)加兩次0.5ul SPA，待芯片表面干燥后，用蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析。

數(shù)據(jù)采集：采用PBSII-C型蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)讀取CM10芯片數(shù)據(jù)。每天使用前用Ciphergen公司提供的標(biāo)準(zhǔn)多肽和低于200kD的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子標(biāo)化校正質(zhì)譜儀，系統(tǒng)質(zhì)量偏差為0.1%。檢測(cè)芯片時(shí)蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)設(shè)置條件如下：激光能量200，檢測(cè)敏感度9，優(yōu)化分子量范圍1~70kD，每個(gè)樣品收集50個(gè)點(diǎn)，采用Ciphergen proteinchip分析軟件自動(dòng)采集數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 因絕大多數(shù)檢測(cè)出的蛋白質(zhì)質(zhì)荷比 (mass-to-charge ratios,m/z)在1000～70,000范圍內(nèi)，故取該范圍為研究區(qū)間。利用Biomarker Wizard軟件對(duì)蛋白質(zhì)峰進(jìn)行歸類分析，設(shè)定信噪比為5，不同組間相同質(zhì)荷比的蛋白質(zhì)峰值比較采用方差分析，統(tǒng)計(jì)分析由該軟件自動(dòng)進(jìn)行。兩個(gè)蛋白質(zhì)峰比較時(shí)，差異蛋白定義為蛋白質(zhì)峰值強(qiáng)度相差1倍以上。利用Biomarker Patterns Software對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行樹(shù)狀分組統(tǒng)計(jì)及相關(guān)性進(jìn)行分析，建立分類樹(shù)模型。

2 結(jié)果

2.1 聲門(mén)上型喉鱗癌組和正常對(duì)照組血清蛋白指紋圖譜 絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)峰數(shù)量和強(qiáng)度在聲門(mén)上型喉鱗癌患者和正常對(duì)照者血清中基本相同，P≤0.05時(shí)，兩組間有9個(gè)差異性表達(dá)蛋白峰，其中3個(gè)在聲門(mén)上型喉鱗癌患者血清中高表達(dá)，m/z分別是9194.06，11681.15 和 51370.19，6 個(gè)低表達(dá)，m/z分別是 8815.96，13767.56，13884.95，14057.50，15879.20和17377.60。P≤0.01時(shí)有4個(gè)顯著差異性表達(dá)蛋白峰，其中3個(gè)在聲門(mén)上型喉鱗癌患者血清中高表達(dá)，m/z分別是 9194.06，11681.15 和 51370.19，1 個(gè)低表達(dá)，m/z是8815.96。兩組血清差異蛋白峰的峰值強(qiáng)度具體數(shù)值比較按P值排列見(jiàn)表1。

表1 聲門(mén)上型喉鱗癌組和正常對(duì)照組血清中差異蛋白峰的表達(dá)強(qiáng)度比較Table 1 Signal intensities of the differentially expressed proteins peaks in serum of supraglottic laryngeal squamous cell cancer and control group

根據(jù)軟件分析按照p值統(tǒng)計(jì)的結(jié)果m/z為11681的蛋白質(zhì)峰為候選差異峰，在聲門(mén)上型喉鱗癌中有高表達(dá)的趨勢(shì)，圖1和圖2為在11400~12000區(qū)段部分SELDI圖譜對(duì)比，圖3為11400~12000區(qū)段部分模擬電泳圖對(duì)比。

圖1 聲門(mén)上型喉鱗癌患者和健康對(duì)照血清11400~12000區(qū)段蛋白質(zhì)指紋圖譜比較Fig1 The spectral view of differently expressed protein peaks at the m/z value from 11400 to 12000 between supraglottic laryngeal squamous cell cancer patients and control group

圖2 聲門(mén)上型喉鱗癌患者和健康對(duì)照者血清11400~12000區(qū)段SELDI圖譜比較圖Fig 2 Differently expressed protein peaks at the M/Z value of 11681 between supraglottic laryngeal cancer patients and control group

2.2 聲門(mén)上型喉鱗癌決策分類樹(shù)診斷模型的建立將Biomarker Wizard軟件分析獲得有差別的蛋白質(zhì)峰建立數(shù)據(jù)庫(kù)，導(dǎo)入Biomarker Pattern統(tǒng)計(jì)分析軟件采用決策聚類樹(shù)分析法進(jìn)行分析處理（靈敏度界定于0.05）。結(jié)果顯示沒(méi)有一個(gè)標(biāo)志蛋白能單獨(dú)將聲門(mén)上型喉鱗癌患者和正常人完全分開(kāi)。分析系統(tǒng)經(jīng)過(guò)篩選，m/z值分別為9194.06，15879.1，51370.1，6624.57，8929.80，1013.77 和 11681.1 的 蛋 白 峰 被Biomarker Pattern軟件自動(dòng)選取用于建立樹(shù)狀決策分類模型，包括8個(gè)結(jié)點(diǎn) (Node)和9個(gè)終結(jié)點(diǎn)(Terminal Node)。

圖3 聲門(mén)上型喉鱗癌患者和正常對(duì)照血清11400~12000區(qū)段SELDI蛋白質(zhì)強(qiáng)度的模擬電泳比較圖Fig 3 Com parison of SELDI gel-view profiles at the m/z value from 11400 to 12000 between supraglottic laryngeal squamous cell cancer patients and control group

應(yīng)用軟件計(jì)算聲門(mén)上型喉鱗癌和正常對(duì)照組各差異蛋白峰的權(quán)重，結(jié)果7個(gè)顯著差異性蛋白質(zhì)峰按變量重要性評(píng)分依次為：M9194_06(100)，M51370_1(98.6),M15879_1(69.06),M6624_57(66.91)，M8929_80(57.75),M11681_1(53.55),M1013_77(44.17)。

采用該分類樹(shù)建立起來(lái)的聲門(mén)上型喉鱗癌診斷模型，在學(xué)習(xí)模式下(learning)，在30例聲門(mén)上型喉鱗癌患者中有26例被樹(shù)狀分析模式正確篩出，靈敏度(sensitivity)為86.66%，30例正常人有27例完全被正確篩出，特異度(specificity)為90%。

3 討論

聲門(mén)上型喉鱗癌是惡性程度較高的一種腫瘤，早期癥狀隱匿，不易引起患者甚至非專科醫(yī)生的注意，確診時(shí)多已晚期。盡管近年來(lái)無(wú)論是外科技術(shù)還是放療、化療、生物靶向治療等綜合治療措施均取得較大進(jìn)展，但聲門(mén)上型喉鱗癌的治療效果仍不理想，生存率較低，嚴(yán)重威脅患者的生存和生活質(zhì)量[1~2]。因此有必要尋求一種有效的早期診斷方法，使疾病在發(fā)生的早期就可以發(fā)現(xiàn)，并得到控制和治療，進(jìn)而提高治愈率，改善患者的預(yù)后。

差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以比較腫瘤和正常細(xì)胞之間的蛋白質(zhì)組異同，從而發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性蛋白找到腫瘤標(biāo)志物。蛋白質(zhì)組技術(shù)的規(guī)模化特點(diǎn)使得同時(shí)找出與腫瘤相關(guān)的多個(gè)蛋白或蛋白群成為可能，從而提高對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)。近年來(lái)，各種蛋白質(zhì)組研究技術(shù)在腫瘤的發(fā)病機(jī)制、早期診斷、分型、療效評(píng)價(jià)等方面獲得應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)了一系列腫瘤相關(guān)蛋白和潛在的腫瘤蛋白標(biāo)志物，為腫瘤研究提供了豐富資源。SELDI技術(shù)是近幾年才發(fā)展起來(lái)的一種新的臨床蛋白組學(xué)方法，具有操作簡(jiǎn)便、可直接分析原始生物樣本（如血清、尿液、胸腹水等）、樣本用量小等特點(diǎn)，同時(shí)適合多樣品平行檢測(cè)和直接進(jìn)行蛋白質(zhì)全景式的搜索和分析，特別是對(duì)小分子量蛋白和低豐度蛋白具有較高的捕獲效果，可以與其他蛋白質(zhì)組學(xué)方法互補(bǔ)，有望成為一種前景廣闊的惡性腫瘤診斷新方法，該技術(shù)較高的特異性和敏感性在卵巢癌、前列腺癌、肝癌和肺癌等已有多篇報(bào)道[3~6]。

卵巢腫瘤在臨床上缺乏敏感特異的腫瘤標(biāo)志物，美國(guó)FDA和NIH的臨床蛋白質(zhì)組研究小組的成員Petricoin等[7]用疏水性蛋白芯片對(duì)50例健康婦女、50例卵巢癌患者的血清蛋白進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康人相比，在質(zhì)荷比值為534、989、2111、2251和2465處的5峰同時(shí)發(fā)生變化，其中卵巢癌患者血清中2251波峰下降，其余均升高，對(duì)于診斷具有重要意義。應(yīng)用該模型對(duì)116例來(lái)自健康、早期和晚期卵巢癌以及良性疾病婦女的血清樣品進(jìn)行盲法分析預(yù)測(cè)。結(jié)果50例卵巢癌的樣品被全部準(zhǔn)確檢出，其中包括18例早期患者。66例非惡性腫瘤人群對(duì)照組中有63例確定為非惡性腫瘤。此結(jié)果表明，該方法的靈敏度為100%(95%CI93～100)，特異度為95%(87%～99%)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為 94%(84%～99%)。結(jié)果說(shuō)明，運(yùn)用SELDI-TOF-MS技術(shù)可以篩選出高效的蛋白標(biāo)記，并可在臨床上用于卵巢癌的早期診斷。

Yang等[8]用SELDI-TOF-MS對(duì)158例肺癌患者和50例正常對(duì)照者的血清進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)有18個(gè)蛋白質(zhì)峰異常表達(dá)。選取其中相對(duì)分子質(zhì)量為11493、6429、8245、5335 和 2538 的 5 個(gè)蛋白質(zhì)峰建立一個(gè)腫瘤標(biāo)志物圖譜，經(jīng)盲法檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)其診斷肺癌的敏感度和特異度分別為86.9%和80%(非小細(xì)胞肺癌的敏感度達(dá)91.4%)，其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為92.4%。其中，對(duì)于早期肺癌的敏感度為79.1%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了目前臨床使用的腫瘤標(biāo)志物。

Zhukov等[9]聯(lián)合激光捕獲顯微切割和蛋白質(zhì)芯片SELDI-TOF-MS技術(shù)，對(duì)正常喉組織、非典型腺瘤樣增生和惡性腫瘤的冰凍切片進(jìn)行激光捕獲顯微切割，獲得純的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，SELDI質(zhì)譜在探測(cè)喉腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)圖譜上具有高度重復(fù)性。(17~23)×103范圍內(nèi)的3個(gè)峰值在腫瘤細(xì)胞系中比正常細(xì)胞明顯增加，其中峰值17.25×103蛋白在任何一個(gè)正常的細(xì)胞樣本中均未被發(fā)現(xiàn)，而在非典型腺瘤樣增生組中呈低水平表達(dá)。

由于血清能反復(fù)獲得，且血液中包含眾多尚未知的生物標(biāo)志物，因此本研究利用血清進(jìn)行其蛋白質(zhì)的分析。細(xì)胞內(nèi)數(shù)以萬(wàn)計(jì)的不同蛋白質(zhì)及其裂解或修飾形式是細(xì)胞生理或病理活動(dòng)的反映，這些蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)片段隨著周圍的血液和淋巴液進(jìn)入循環(huán)，因而在血清蛋白質(zhì)中，除高豐度或大分子的駐留蛋白如白蛋白、球蛋白和其它載體蛋白外，還有低豐度的小分子蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段，而后者包含著大量的診斷信息[10]。

本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片SELDI-TOF-MS技術(shù)檢測(cè)了50例聲門(mén)上型喉鱗癌和50名正對(duì)照血清標(biāo)本。發(fā)現(xiàn)兩組間有9個(gè)差異性表達(dá)蛋白峰，其中3個(gè)在聲門(mén)上型喉鱗癌患者血清中高表達(dá)，m/z分別是9194.06，11681.15和51370.19，6個(gè)在聲門(mén)上型喉鱗癌患者血清中低表達(dá)，m/z分別是8815.96,13767.56,13884.95,14057.50,15879.20和17377.60。應(yīng)用數(shù)據(jù)建立分類樹(shù)模型，獲得了一個(gè)由7個(gè)蛋白9194.06,51370.1,15879.1,6624.57,8929.80,11681.1,1013.77組成的標(biāo)志蛋白組合模式。在訓(xùn)練組中，該模式的敏感性和特異性分別為86.66%和90%，是一種高敏感性、高特異性的聲門(mén)上型喉鱗癌診斷方法，有望成為臨床上從高危人群中快速方便篩查聲門(mén)上型喉鱗癌患者的診斷平臺(tái)。

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