高云燕 劉麗華 歐植澤 李 楊國(guó)強(qiáng) 王雪松

(1西北工業(yè)大學(xué)理學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系,西安 710072;2中國(guó)科學(xué)院理化技術(shù)研究所,光化學(xué)轉(zhuǎn)換與功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100090;3中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所,光化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100090)

膽固醇修飾富勒烯/γ-環(huán)糊精包結(jié)復(fù)合物的生物活性

高云燕1,*劉麗華1歐植澤1,*李2楊國(guó)強(qiáng)3王雪松2

(1西北工業(yè)大學(xué)理學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系,西安 710072;2中國(guó)科學(xué)院理化技術(shù)研究所,光化學(xué)轉(zhuǎn)換與功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100090;3中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所,光化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100090)

采用Bingel-Hirsch反應(yīng)合成了膽固醇修飾的富勒烯(CHL-C60),通過核磁共振(NMR)、質(zhì)譜(MS)、元素分析對(duì)CHL-C60的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征.γ-環(huán)糊精(γ-CD)對(duì)甾環(huán)具有較強(qiáng)的包結(jié)能力,能夠與CHL-C60形成包結(jié)復(fù)合物 (CHL-C60/γ-CD),從而有效提高CHL-C60的水溶性.紫外-可見吸收光譜和熒光光譜研究結(jié)果表明,CHLC60能夠從γ-CD的疏水空腔中解離出來,與人血清白蛋白(HSA)及牛血清白蛋白(BSA)形成穩(wěn)定的復(fù)合體,其結(jié)合常數(shù)分別為5.73×104和7.05×104L·moL-1.無氧條件下,CHL-C60/γ-CD通過光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移作用斷裂pBR322質(zhì)粒脫氧核糖核酸(DNA),其效率可達(dá)60.5%.

富勒烯;環(huán)糊精包結(jié)物;血清白蛋白;DNA斷裂

C60是目前研究得比較多的一種富勒烯化合物.其獨(dú)特的三維共軛結(jié)構(gòu)賦予了它特殊的物理和化學(xué)性質(zhì),有望在材料科學(xué)、生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[1-3].C60衍生物所具有的生物活性越來越受到人們的重視,其中包括抗腫瘤、抗艾滋病毒、酶活性抑制、DNA的選擇性斷裂、清除自由基等活性.作為藥物或藥物載體是C60衍生物最具前景的應(yīng)用領(lǐng)域之一[4-5].有文獻(xiàn)報(bào)道,將C60與金剛烷[6]、類黃酮[7]、二氫嘧啶[8]、芳基哌嗪[9]等具有生物活性的基團(tuán)相連接,可以開發(fā)出具有新的生物活性的藥物.藥物與血漿蛋白質(zhì)相互作用是決定藥物在體內(nèi)分布和發(fā)揮作用的一個(gè)重要因素[10-11].研究C60衍生物與血漿蛋白質(zhì)的相互作用,有助于了解取代基團(tuán)對(duì)富勒烯衍生物在體內(nèi)的分布、生物代謝途徑的影響[12-13],為設(shè)計(jì)、合成新型富勒烯C60藥物提供重要理論基礎(chǔ).

由于富勒烯具有強(qiáng)烈的疏水性,使得富勒烯衍生物在水溶液中的溶解度非常低.利用富勒烯與親水性聚合物[14-15]、有機(jī)染料[16-17]、杯芳烴[18]或環(huán)糊精[19-22]形成超分子體系是改善富勒烯及其衍生物水溶性的一種重要方法.目前,環(huán)糊精對(duì)富勒烯衍生物的包結(jié)作用研究還比較少[22].

甾體化合物是存在于生物體內(nèi)的一類天然、無毒的化合物,已用于改善聚合物、卟啉、核酸或蛋白質(zhì)等的生物相容性,可提高細(xì)胞對(duì)相應(yīng)化合物的吸收效率[23-24].近年來,甾環(huán)修飾C60衍生物的生物活性引起了人們的關(guān)注,如改變質(zhì)膜的物理狀態(tài)或降低癌細(xì)胞的生存率[25-27].本文合成了膽固醇修飾的C60衍生物CHL-C60,利用甾環(huán)化合物與環(huán)糊精具有較強(qiáng)的結(jié)合能力的特點(diǎn)[28],采用環(huán)糊精包結(jié)作用增加CHL-C60的水溶性,研究了CHL-C60/γ-CD與血清白蛋白的作用以及光損傷DNA等生物活性.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

γ-環(huán)糊精(γ-CD)、1,8-二氮雜環(huán)[5,4,0]十一烯-7 (DBU)、富勒烯C60、N,N-二甲胺基吡啶(DMAP)、人血清白蛋白(HSA,Fraction V)、牛血清白蛋白(BSA)、pBR322質(zhì)粒DNA均購自Sigma公司,美國(guó);膽固醇、丙二酸、2,6-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司分析純?cè)噭?使用前未經(jīng)進(jìn)一步處理;其余試劑均為分析純,購自北京化工廠.所用有機(jī)溶劑均經(jīng)過無水處理后,使用前重蒸.水溶液配制采用二次蒸餾水配制.所用緩沖溶液均為Tris-HCl溶液(10 mmol·L-1, pH 7.2).

所用儀器:Hitachi UV-3010紫外可見吸收光譜儀,日本;Hitachi F-4600型熒光光譜儀,日本;Bio-Rad Universal Hood II凝膠成像系統(tǒng),美國(guó);北京六一DYCP-44N凝膠電泳儀.

1.2 合 成

化合物2:將丙二酸(1 g,9.6 mmol),膽固醇(化合物 1,7.4 g,19.13 mmol),N,N-二甲基胺基吡啶(0.122 g,1 mmol)溶解于干燥的二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液中(1/1,V/V).冷卻到0℃,通氮?dú)鈼l件下逐滴滴加2,6-二環(huán)己基碳二亞胺(4.37 g, 21.2 mmol),上述混合溶液在室溫下攪拌過夜.經(jīng)柱層析分離得到化合物2,產(chǎn)率為73%.1H NMR (CDCl3)測(cè)定得:5.37(s 2H),4.68(m,2H),3.32(s,2H), 2.35-0.65(m,86H);MS(MALDI-TOF)測(cè)定得:m/z 841.5(理論值以C57H92O4計(jì)算為840.7).元素分析:分子式C57H92O4計(jì)算值(%)為C,81.37;H,11.02;實(shí)測(cè)值(%)為C,81.56;H,11.31.

化合物3(CHL-C60):將C60(36 mg,0.05 mmol),化合物2(37.0 mg,0.44 mmol)、CBr4(22.6 mg,0.068 mmol)溶解于新蒸干燥甲苯中,通入氮?dú)鈼l件下滴加DBU(12.2 mg,0.08 mmol)的甲苯溶液,溶液逐漸由紫色變?yōu)榫萍t色.避光攪拌24 h后,將反應(yīng)溶液減壓蒸餾至干.采用柱層析分離得到化合物3,產(chǎn)率25%.1H NMR(CS2,D2O鎖場(chǎng))測(cè)定得:5.65(s,2H), 5.08(s,2H),2.68(m,4H),2.25-1.12(m,76H),1.09(m, 6H).13CNMR(100MHZ,CS2,D2O鎖場(chǎng))測(cè)定得:161.86, 161.81,145.80,145.74,145.46,145.41,145.38,145.32, 144.98,144.95,144.91,144.85,144.78,144.15,143.34, 142.51,142.46,142.09,142.03,141.18,141.13,139.38, 139.34,139.13,139.06,124.01,76.95,72.12,72.04, 52.8,52.7,57.25,57.19,42.77,42.71,40.47,40.41, 38.58,38.52,37.68,37.62,37.07,37.01,36.90,36.84, 36.41,36.37,32.81,32.77,32.35,32.28,30.49,29.13, 29.10,28.78,28.74,28.42,28.37,25.18,25.14,24.60, 24.56,23.48,23.45,23.23,23.20,21.79,21.74,19.87, 19.82,19.40,19.35,12.52,12.47.MS(MALDI-TOF)測(cè)定得:m/z 1559.1(理論值以 C117H90O4計(jì)算為1559.6).元素分析測(cè)定得:分子式C117H90O4計(jì)算值(%)為C,90.08;H,5.82.實(shí)測(cè)值(%)為C,90.14;H, 5.86.

1.3 CHL-C60的γ-環(huán)糊精包合物溶液制備

CHL-C60/γ-環(huán)糊精包合物水溶液的制備按照文獻(xiàn)方法[16,29]進(jìn)行,具體過程如下:將不同質(zhì)量的CHLC60(0.1-2 mg)加入到20 mL γ-環(huán)糊精(200 μmol·L-1)的Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.2)中,室溫下超聲(200 W)1.5 h,然后避光攪拌過夜.未溶解的CHL-C60采用高速離心(6000 r·min-1)15 min的方法除去.將未溶解的CHL-C60溶于甲苯中,通過紫外-可見光譜檢測(cè),可以得知被γ-環(huán)糊精包結(jié)的CHL-C60的量.得到的CHL-C60/γ-CD包結(jié)物緩沖溶液直接用于光譜測(cè)定,與血清白蛋白的作用以及DNA光損傷等實(shí)驗(yàn).

1.4 CHL-C60與血清白蛋白相互作用的熒光光譜測(cè)定

配制濃度為100 μmol·L-1的血清白蛋白Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.2)備用.固定血清白蛋白的濃度為3 μmol·L-1,分別加入不同濃度的CHL-C60/γ-CD溶液.混合后靜置12 h,然后采用295 nm的光激發(fā),研究CHL-C60對(duì)血清白蛋白的熒光猝滅作用.CHLC60與血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)Ka采用最小二乘法對(duì)式(1)進(jìn)行非線性擬合得到[30-31]:

式(1)中F0和F分別為CHL-C60/γ-CD加入前后血清白蛋白的熒光強(qiáng)度,[SA]為相應(yīng)血清白蛋白(serum albumin)的摩爾濃度.利用ΔF對(duì)CHL-C60的濃度作圖求取血清白蛋白與CHL-C60的結(jié)合常數(shù)Ka.

1.5 DNA斷裂實(shí)驗(yàn)

取30 μL pBR322 DNA溶液(pH 7.2,0.05 μg· mL-1)與等體積的CHL-C60/γ-CD復(fù)合物溶液(CHLC60,10 μmol·L-1;γ-CD,100 μmol·L-1)混合,室溫下通N2除氧15 min.在暗處靜置或用高壓汞燈(采用濾光片濾掉λ＜300 nm的光)光照10至30 min.利用0.9%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA進(jìn)行分離,溴乙啶染色后,采用Bio-Rad Universal Hood II凝膠成像系統(tǒng)測(cè)定各DNA組分的熒光強(qiáng)度.通過熒光強(qiáng)度比較,可獲得超螺旋結(jié)構(gòu)DNA(Form I,supercoiled)和帶切口的DNA(Form II,nicked)的相對(duì)百分含量.通過式(2)求取DNA的損傷率(d(%))[32]:

式(2)中FII0和FII分別為光照前后帶切口DNA的熒光強(qiáng)度,FI0為光照前超螺旋DNA的熒光強(qiáng)度.

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物合成

Bingel-Hirsch反應(yīng)具有產(chǎn)率高、反應(yīng)條件溫和、活潑亞甲基前體易得等特點(diǎn),已成為廣泛使用的C60化學(xué)修飾方法之一[33-35].首先通過酯化反應(yīng)合成膽固醇的丙二酸酯(化合物2),然后在DBU和CBr4存在條件下與C60進(jìn)行Bingel-Hirsch反應(yīng),得到膽固醇修飾富勒烯衍生物3(CHL-C60),具體合成步驟見圖1.利用1H NMR、13C NMR、激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)等方法對(duì)目標(biāo)化合物CHL-C60進(jìn)行鑒定.

圖1 化合物3(CHL-C60)的合成步驟Fig.1 Synthesis of compound 3(CHL-C60)reaction conditions:i)malonic acid,N,N′-dicyclohexylcarbodiimide (DCC),4-dimethylaminopyridine(DMAP),dimethyl formamide (DMF)-CH2Cl2;(1/1,V/V),0℃;ii)C60,CBr4,1,8-diazabicyclo[5.4.0] undec-7-ene(DBU),toluene,room temperature

13C NMR結(jié)果顯示,在δ為139-146區(qū)間有21個(gè)C60的特征峰,其中13個(gè)峰各包含2個(gè)碳原子,8個(gè)峰各包含了4個(gè)碳原子,這與文獻(xiàn)報(bào)道的Bingel-Hirsch反應(yīng)產(chǎn)物具有C2v對(duì)稱性相符[36-37];同時(shí)酯羰基的特征峰也出現(xiàn)在δ 161.8左右.從1H-13C異核單量子相干譜(HSQC)二維核磁譜(圖2)中也可見δ為5.65(=CH)與124.0,δ為5.08(CH—O—CO)與76.9處,給出相關(guān)的甾環(huán)化合物特征峰[38].基質(zhì)輔助MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)證明了CHL-C60分子離子峰的存在.這些結(jié)果表明,在CHL-C60中膽固醇基團(tuán)與C60通過共價(jià)鍵連接.

圖2 CHL-C60的1H-13C異核單量子相干譜(HSQC)譜圖Fig.2 1H-13C heteronuclear single quantum coherence (HSQC)spectrum of CHL-C60

2.2 CHL-C60的紫外-可見吸收光譜

CHL-C60在普通有機(jī)溶劑中,如四氫呋喃(THF)、氯仿、甲苯中都有較好的溶解度,但在水中的溶解度很低(＜1 μmol·L-1).加入γ-CD,在超聲波條件下可以使 CHL-C60在水中的溶解度大幅度增加(20 μmol·L-1).對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明,未經(jīng)修飾的C60在γ-CD (200 μmol·L-1)的緩沖溶液中進(jìn)行超聲、攪拌,不能獲得水溶性的C60/γ-CD包結(jié)物.文獻(xiàn)報(bào)道C60的環(huán)糊精包結(jié)物一般需在有機(jī)溶劑、高速振動(dòng)或沸水浴等比較劇烈的條件下進(jìn)行[19-22].環(huán)糊精對(duì)甾環(huán)化合物具有較強(qiáng)的包結(jié)能力,其結(jié)合常數(shù)達(dá)到103-104L·moL-1[28].因此在γ-CD存在下,CHL-C60在水中的溶解度增加,主要來自于γ-CD對(duì)CHL-C60中膽固醇基團(tuán)的包結(jié)作用.但是β-環(huán)糊精對(duì)CHL-C60在水中的溶解度影響較小.這可能是γ-環(huán)糊精比β-環(huán)糊精具有更大的空腔,能夠更好地容納側(cè)鏈修飾的甾環(huán)衍生物[39-40],這使得加入γ-環(huán)糊精能夠有效增溶CHL-C60.

圖3為在不同溶劑條件下CHL-C60的紫外-可見吸收譜圖.在THF中CHL-C60的吸收峰位于257, 326和426 nm處.在緩沖溶液中的吸收峰紅移至269.5和333 nm,同時(shí)426 nm處的吸收峰消失;加入HSA或BSA后,CHL-C60/γ-CD的吸收明顯增強(qiáng).為了消除血清白蛋白在紫外區(qū)有吸收的影響,在參比溶液中也加入了同等濃度的血清白蛋白,因此吸收光譜的變化主要來源于CHL-C60與血清白蛋白之間的相互作用.

2.3 CHL-C60與血清白蛋白相互作用的熒光光譜

圖3 CHL-C60(10 μmol·L-1)的紫外-可見吸收光譜Fig.3 UV-Vis spectra of CHL-C60(10 μmol·L-1)(1)THF;(2)buffer solution(pH 7.2),HSA(10 μmol·L-1),γ-CD(100 μmol·L-1);(3)buffer solution(pH 7.2),BSA(10 μmol·L-1),γ-CD(100μmol·L-1);(4)buffer solution(pH 7.2),γ-CD(100 μmol·L-1)

血清白蛋白是血清中含量最高的一種蛋白質(zhì),也是多種藥物的有效載體.研究富勒烯衍生物與血清白蛋白的相互作用對(duì)了解富勒烯在體內(nèi)的輸送和代謝途徑具有重要的意義[41-43].血清白蛋白中色氨酸殘基的內(nèi)源性熒光(λex/λem=295/342)對(duì)環(huán)境變化非常敏感,常用于研究血清蛋白與有機(jī)化合物的相互作用.由圖4可以看出,加入CHL-C60/γ-CD后, HSA(圖4(a))和BSA的內(nèi)源熒光強(qiáng)度有規(guī)律地降低.對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明,即使加入高濃度的γ-CD(1 mmol· L-1),也不影響血清白蛋白的熒光.這表明,熒光猝滅作用主要來自于CHL-C60與血清白蛋白之間的相互作用,即CHL-C60可以從γ-CD的疏水空腔中解離出來,繼而與血清白蛋白發(fā)生作用(式(3)).

圖4 加入CHL-C60/γ-CD溶液對(duì)人血清白蛋白(a)和牛血清白蛋白(b)的熒光猝滅作用Fig.4 Fluorescence quenching of human serum albumin(HSA)(a)and bovine serum albumin(BSA)(b)uponaddition of CHL-C60/γ-CD solutionThe concentration ratio for CHL-C60and γ-CD is 1∶10,λex=295 nm

圖5 (a)CHL-C60與HSA、BSA相互作用的Stern-Volmer圖及(b)利用非線性最小二乘法對(duì)其熒光強(qiáng)度變化進(jìn)行擬合Fig.5 (a)Stern-Volmer plots of the interaction of CHL-C60with HSA,BSA and(b)non-linear least squares analysis of the change in fluorescence intensity of serum albuminλex=342 nm

為了進(jìn)一步研究CHL-C60與血清白蛋白的作用機(jī)理,采用Stern-Volmer方程(式(4))對(duì)上述熒光猝滅過程進(jìn)行分析[44]:

式(4)中F0′和F′分別為加入猝滅劑CHL-C60前后血清白蛋白在342 nm處的熒光強(qiáng)度,Kq為熒光猝滅速率常數(shù),τ0為血清白蛋白的熒光壽命.本文對(duì)HSA及BSA的相對(duì)熒光強(qiáng)度F0′/F′對(duì)猝滅劑CHLC60的濃度作圖得圖5.由圖5可見,對(duì)HSA,其相對(duì)熒光強(qiáng)度F0′/F′對(duì)猝滅劑CHL-C60的濃度呈良好的線性關(guān)系(相關(guān)系數(shù)R=0.9969),說明該體系內(nèi)只有一種猝滅過程.直線的斜率為1.02×105L·mol-1,一般生物大分子的熒光壽命為τ0=1×10-8s[45],計(jì)算得到猝滅速率常數(shù)Kq約為1.02×1013L·mol-1·s-1,遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)(2×1010L·mol-1·s-1)[44],表明上述猝滅過程不是動(dòng)態(tài)猝滅,而有可能是靜態(tài)猝滅.紫外-可見吸收光譜(圖3)表明,在基態(tài)條件下CHL-C60與HSA存在強(qiáng)烈的相互作用,進(jìn)一步證明是靜態(tài)猝滅機(jī)理.對(duì)于BSA,F0′/F′與CHL-C60濃度作圖得到了一條偏向y軸的曲線.這表明,CHL-C60對(duì)BSA的熒光猝滅作用同時(shí)存在動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種機(jī)理[46-47].加入BSA后,CHL-C60在紫外-可見光區(qū)的吸收發(fā)生明顯變化,也說明CHL-C60與BSA能形成穩(wěn)定的復(fù)合體(圖3).熒光猝滅實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CHL-C60能夠與HSA和BSA形成穩(wěn)定的富勒烯/蛋白質(zhì)復(fù)合體,富勒烯與色氨酸殘基的電子轉(zhuǎn)移作用可能是CHLC60猝滅血清白蛋白熒光的重要原因[48-49].

文獻(xiàn)報(bào)道[30,50]富勒烯具有合適的空間尺寸,能夠與血清白蛋白或富勒烯抗體的疏水空腔結(jié)合,形成比例為1∶1的復(fù)合物.利用342 nm處的熒光變化對(duì)CHL-C60的濃度作圖,采用非線性最小二乘法進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合(圖5(b)),計(jì)算得到CHL-C60與HSA, BSA的結(jié)合常數(shù)Ka分別為5.73×104L·moL-1(R= 0.9991)和7.05×104L·moL-1(R=0.9972).良好的非線性關(guān)系擬合程度表明,CHL-C60與HSA,BSA均形成了1∶1的復(fù)合物.

圖6 pBR322質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖(a)及CHLC60/γ-CD復(fù)合物存在條件下超螺旋結(jié)(Form I)和帶切口(Form II)DNA的相對(duì)含量隨光照時(shí)間的變化(b)Fig.6 Agrose gel electrophoretic patterns of pBR322 plasmid DNA(a)and the change in relative amount of supercoiled(Form I)and nicked(Form II)DNA upon irradiation time in the presence of CHL-C60/γ-CD complex(b)lane 1:no reagent in 10 mmol·L-1Tris-HCl(pH 7.2);lane 2:γ-CD(1 mmol·L-1);lane 3-6:CHL-C60(10 μmol·L-1),γ-CD(100 μmol·L-1)

2.4 CHL-C60/γ-CD對(duì)DNA的光損傷作用

富勒烯是一類優(yōu)良的電子受體,在受到光激發(fā)后接受電子能力更強(qiáng).研究發(fā)現(xiàn)富勒烯能與胺類化合物[51]以及DNA還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)等具有生物活性的物質(zhì)[52]發(fā)生電子轉(zhuǎn)移作用,從而在光電器件、生物科學(xué)領(lǐng)域表現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景.本文采用pBR322質(zhì)粒DNA作為模型化合物,研究CHL-C60/γ-CD對(duì)DNA的光損傷作用.在暗處靜置時(shí),無論是否加入CHL-C60/γ-CD,DNA的組成未發(fā)生變化(圖6(a),第1、3泳道).加入CHLC60/γ-CD,并采用汞燈光照(λ>300 nm)時(shí),DNA的組成發(fā)生了明顯變化(圖6(a),第4、6泳道).隨著光照時(shí)間的增加,超螺旋結(jié)構(gòu)Form I型DNA含量由86.2%逐漸降低至34.0%,而帶切口Form II型DNA含量由13.8%逐漸升高至66.0%(圖6(b)).光照30 min后,CHL-C60對(duì)pBR322質(zhì)粒DNA的光損傷效率達(dá)到60.5%.對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明,加入γ-CD光照20 min,DNA的含量不發(fā)生變化(圖6(a),第2泳道),說明DNA的光損傷主要來自于CHL-C60和pBR322質(zhì)粒DNA之間的相互作用.無氧條件下,富勒烯衍生物能夠通過光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)斷裂DNA[14].文獻(xiàn)報(bào)道[53]富勒烯被杯芳烴包結(jié)后,仍然可以通過電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)損傷DNA.說明形成主-客體超分子既可以增強(qiáng)富勒烯及其衍生物的水溶性,又保持了富勒烯光照斷裂DNA的能力.本文采用高壓汞燈光照樣品,能夠有效地激發(fā)CHL-C60,處于激發(fā)態(tài)的CHL-C60與DNA發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)(式(5)),

從而導(dǎo)致DNA的斷裂.文獻(xiàn)報(bào)道[54]C60及其衍生物在有氧條件下,可通過超氧負(fù)離子和單重態(tài)氧光損傷DNA,研究CHL-C60在有氧條件下對(duì)DNA的光損傷作用將有助于更進(jìn)一步地了解其生理活性.

3 結(jié) 論

采用Bingel-Hirsch反應(yīng)合成了膽固醇修飾富勒烯C60衍生物(CHL-C60),通過核磁共振、質(zhì)譜、元素分析等多種手段對(duì)CHL-C60的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征.β-環(huán)糊精對(duì)CHL-C60在水中的溶解度影響較小,而γ-CD可以通過包結(jié)CHL-C60中側(cè)鏈修飾的甾環(huán),形成CHL-C60/γ-CD包結(jié)復(fù)合物,增強(qiáng)CHL-C60的水溶性.加入HSA或BSA后,CHL-C60/γ-CD的吸收明顯增強(qiáng);同時(shí)CHL-C60/γ-CD能猝滅HSA和BSA的內(nèi)源性熒光,說明CHL-C60與血清白蛋白之間具有較強(qiáng)的相互作用,即CHL-C60可以從γ-CD的疏水空腔中解離出來,繼而與血清白蛋白發(fā)生作用.采用非線性最小二乘法對(duì)加入CHL-C60后血清白蛋白的熒光變化數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,良好的非線性關(guān)系擬合程度表明CHL-C60與HSA,BSA均形成了1∶1的復(fù)合物,其結(jié)合常數(shù)分別為5.73×104和7.05×104L· mol-1.光照條件下,CHL-C60/γ-CD通過光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移作用對(duì)DNA進(jìn)行有效的光損傷.結(jié)果表明,通過與γ-CD形成主-客體超分子既可以增強(qiáng)富勒烯衍生物CHL-C60的水溶性,又保持了CHL-C60的與蛋白質(zhì)結(jié)合、光照斷裂DNA等生物活性.

致謝: 作者對(duì)中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所向俊鋒副研究員在核磁測(cè)試工作中給予的大力幫助表示感謝.

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August 28,2009;Revised:November 12,2009;Published on Web:January 5,2010.

Biological Activity of a Cholesterol Modified Fullerene/γ-Cyclodextrin Inclusion Complex

GAO Yun-Yan1,*LIU Li-Hua1OU Zhi-Ze1,*LI Yi2YANG Guo-Qiang3WANG Xue-Song2
(1Department of Applied Chemistry,School of Science,Northwestern Polytechnical University,Xi′an 710072,P.R.China;2Key Laboratory of Photochemical Conversion and Optoelectronic Materials,Technical Institute of Physics and Chemistry, Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,P.R.China;3Key Laboratory of Photochemistry,Institute of Chemistry, Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,P.R.China)

A cholesterol modified fullerene(CHL-C60)was synthesized using the Bingel-Hirsch reaction and was characterized by nuclear magnetic resonance(NMR),mass spectra(MS),elemental analysis(EA).Results of UV-Vis spectrum and fluorescence spectrum indicate that CHL-C60forms an inclusion complex with γ-cyclodextrin(γ-CD)due to the strong interaction between γ-cyclodextrin and the steroid ring.The water solubility of CHL-C60is enhanced significantly.CHL-C60can dissociate from cyclodextrin and subsequently bind to human serum albumin(HSA)and bovine serum albumin(BSA)with association constants of 5.73×104and 7.05×104L·moL-1,respectively.The efficiency of desoxyribonucleic acid(DNA)photocleavage for CHL-C60/γ-CD is as high as 60.5%under anaerobic conditions,which is caused by photoinduced electron transfer from pBR322 plasmid DNA to CHL-C60.

Fullerene;Cyclodextrin inclusion complex;Serum albumin;DNA cleavage

O641

*Corresponding authors.Email:gaoyunyan@nwpu.edu.cn,ouzhize@nwpu.edu.cn;Tel:+86-29-88431677.

The project was supported by the Scientific Research Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars,the Ministry of Education,China (N9YK0003,N9YK0005),Foundation for Fundamental Research of Northwestern Polytechnical University,China(W018113),and Ao Xiang Foundation for Youth Teachers of Northwestern Polytechnical University,China(R0120).

教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金(N9YK0003,N9YK0005)、西北工業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)研究基金(W018113)、西北工業(yè)大學(xué)翱翔之星項(xiàng)目(R0120)資助