李小娟, 劉二明*, 譚小平, 肖啟明, 劉年喜, 王金輝

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長沙 410128;2.湖南省植保植檢站,長沙 410005)

水稻稻曲病(false smut of rice)又叫假黑穗病、綠黑穗病、黑球病、青粉病和豐收病,是水稻穗部的真菌性病害,其病原菌的無性階段為有絲分裂孢子真菌稻綠核菌[Ustilaginoidea virens(Cke)Tak],有性世代為子囊菌中的稻麥角菌(Claviceps oryzaesativae Hashiok)。該病害在世界產(chǎn)稻區(qū)都有發(fā)生[1],目前呈加重趨勢,它不僅降低水稻產(chǎn)量,嚴(yán)重影響稻米品質(zhì)[2],而且產(chǎn)生的稻曲病菌毒素,對人、畜有毒,影響人、畜健康[3-4]。

目前對稻曲球的組織生化研究很少,與抗稻曲病相關(guān)的生化機制也未見系統(tǒng)的研究。代光輝等[5]報道,抗感病品種中都存在過氧化物酶和木栓質(zhì),而且差異不大,可能與抗病性無關(guān);木質(zhì)素和多酚類物質(zhì)在抗、感2個品種中也都存在,且抗病品種中的含量明顯多于感病品種。木質(zhì)素和多酚類物質(zhì)可能在抗病中起著某種作用,有可能作為篩選抗病品種的一個指標(biāo)。代光輝等觀察顯示,在稻曲球中存在能發(fā)出熒光的“蝴蝶”型結(jié)構(gòu),稻曲球內(nèi)不含過氧化物酶、木栓質(zhì)、木質(zhì)素和單寧類物質(zhì)。苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)等防御酶在其他作物病害中對抗病性的影響有較多的報道[6-9]。

本試驗用稻曲病菌分生孢子接種不同抗、感病的水稻品種,測定水稻3種酶活性的變化情況,期望從有關(guān)酶的生化測定找到與抗病性相關(guān)的指標(biāo),為抗性鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試品種

在溫室內(nèi)栽培12個抗感程度不同的水稻品種,用直徑20 cm、高35 cm的灰塑料桶栽培,每桶栽3株,3次重復(fù)。這些供試品種在田間抗性表現(xiàn)從感病到抗病依次為:紅蓮優(yōu)6號、兩優(yōu)培九、Ⅱ優(yōu)58、Ⅱ優(yōu) 416、新香優(yōu) 207、汕優(yōu) 46、威優(yōu) 207、特優(yōu)111、金優(yōu) 191、汕優(yōu) 63、K 優(yōu) 817、威優(yōu) 46。

1.2 接種體的培養(yǎng)

將分離得到的稻曲病菌厚垣孢子挑取到裝100 mL馬鈴薯蔗糖(PS)培養(yǎng)液的三角瓶中,在水平搖床上26℃黑暗條件下130 r/min振蕩培養(yǎng)7 d,產(chǎn)生的分生孢子用于接種,濃度為100×視野下200個孢子。

1.3 接種時期與方法

在水稻孕穗末期即破口前3～7 d,用注射器將接種體注射到水稻穗部。接種后溫室內(nèi)用加濕器加濕,溫度控制為28℃。

1.4 取樣

分別在水稻孕穗末期接種前、接種后 1、3、5、7 d,剪取接種部位進行酶的活性測定。

1.5 與抗性相關(guān)的生化指標(biāo)的測定方法

1.5.1 PAL活性的測定

參照Meyer等[10]的方法。稱取待測定材料各1 g,加入 10 mL預(yù)冷的酶提取緩沖液(含1 mmol/L EDTA、20 mmol/Lβ-巰 基乙醇和 1%PVP 的0.1 mol/L pH 8.7的PBS)勻漿,4 ℃、10 000 r/min離心20 min。上清液即為酶粗提液。取2.5 mL酶提取液,加50μL 0.6 mmol/L L-苯丙氨酸、100μL 0.1 mol/L p H 8.7的PBS,40℃保溫60 min,加入0.2 mL 2 mol/L的 HCl終止反應(yīng),測290 nm吸光值,以不加酶液的反應(yīng)體系標(biāo)定為 0,以ΔA290/(min·g)FW為一個酶活力單位。分別測定接種前 、接種后1、3、5、7 d 的抗病品種、感病品種和對照的A值,根據(jù) A值,比較不同品種的苯丙氨酸解氨酶的活性情況。

1.5.2 POD活性的測定

參照Chance和Maehly[11]的方法進行測定,稱取1 g取樣材料,加入預(yù)冷的酶提取液10 mL(含1%PVP的 0.05 mol/L、p H 7.0的 PBS)勻漿,10 000r/min、4℃離心 20 min,上清為酶粗提液。在3 mL石英比色皿中加入2.8 mL過氧化物反應(yīng)液(含0.015 mol/L H 2O2的 0.05 mol/L、p H 7.0的PBS)、0.2 mL過氧化物酶提取液,記其在240 nm的吸光值,測酶活,以不加酶液的反應(yīng)體系標(biāo)定為0,以ΔA240/(min·g)為一個酶活力單位。分別測定接種前、接種后 1、3、5、7 d各品種和對照的 A值,根據(jù)A值,比較抗病品種、感病品種及對照的過氧化物酶的活性變化情況。

1.5.3 PPO活性的測定

參照文獻[12]的測定方法,稱取1 g取樣材料洗凈、擦干并剪碎,加入8 mL冰冷的p H 5.6的檸檬酸-磷酸緩沖液,研磨成勻漿,4℃10 000 r/min離心15 min,上清液為酶提取液,取3.8 mL緩沖液,0.2 mL酶液,1 mL 0.1 mol/L的鄰苯二酚,37℃反應(yīng)30 min,立即用20%的三氯乙酸終止反應(yīng),以不加酶液的反應(yīng)體系標(biāo)定為0,離心后于420 nm測定其A值,以A值變化0.01為一個酶活性單位。分別測出接種前、接種后 1、3、5、7 d各品種和對照的A值,根據(jù)A值,比較抗病品種、感病品種及對照的多酚氧化酶的活性變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAL的活性變化

試驗結(jié)果如圖1,接種前各品種相差不大,接種后第1天抗病品種威優(yōu)46的PAL活性增加了10.5/(min·g),K優(yōu)817增加了8.9/(min·g);感病品種紅蓮優(yōu)6號接種1 d后酶活性稍有下降,感病品種兩優(yōu)培九酶活性也變化不大,以后幾天的酶活性都呈下降趨勢,且比接種前的還要低,但特優(yōu)111、K優(yōu)817、威優(yōu)46要比接種前的稍高。在接種后1～3 d是酶的變化活躍期。

圖1 12個水稻品種接種稻曲病菌后的PAL活性變化

結(jié)果表明接種后抗病品種比感病品種的PAL活性增加快,酶活高峰期要高。

2.2 POD的活性變化

接種后各品種的酶活性都呈上升趨勢(圖2),尤其是威優(yōu)46、K優(yōu)817,接種后第1天酶活性增幅較大,ΔA240分別增加了 9.6、7.3/(min·g);過了高峰期后酶活性又緩慢下降;感病品種兩優(yōu)培九、紅蓮優(yōu)6號、特優(yōu)111接種后酶活性變化不太明顯,只是緩慢上升。結(jié)果表明,接種后抗病品種比感病品種POD的變化要快,酶活高峰期要高。

2.3 PPO的活性變化

如圖3,接種前各品種的PPO活性相差不大,接種后第1天PPO活性達(dá)到最高峰,抗病品種威優(yōu)46、K 優(yōu) 817、汕優(yōu)63增幅很大,ΔA420分別增加了0.062、0.056、0.055/(min ·μg),感病品種兩優(yōu)培九、紅蓮優(yōu)6號PPO活性增加緩慢。

結(jié)果表明,接種后抗病品種比感病品種PPO增加的幅度大,酶活高峰期要高。

3 討論

各水稻品種接種稻曲病分生孢子后,一些抗病品種如威優(yōu)46、K優(yōu)817的PAL、POD、PPO活性在接種后第1天達(dá)到最高峰,且變化幅度最大。一些感病品種如兩優(yōu)培九、紅蓮優(yōu) 6號接種后PAL、POD、PPO活性變化不很明顯,先有少許緩慢上升,然后慢慢下降。根據(jù)對12個抗感水平不同的品種接種后的PAL、POD、PPO活性的測定,可以看出抗病品種的這些酶活性在接種后迅速升高,變化幅度較大;而感病品種則比抗性品種的酶活性要低,接種后酶活性緩慢增加,有些甚至下降,變化幅度不明顯。有些品種的酶活性變化不穩(wěn)定,如金優(yōu)191田間表現(xiàn)為抗病,但接種后PAL、POD活性變化緩慢,PPO活性變化幅度大,原因需進一步研究。本試驗得出過氧化物酶與抗病性相關(guān),與代光輝等[5]報道的可能無關(guān)不符;他報道的多酚類物質(zhì)在抗、感2個品種中也都存在,且抗病品種中的含量明顯多于感病品種,在本文中得到進一步的證實。

與抗性相關(guān)的一些其他生化指標(biāo)如代光輝等[5]提到的木栓質(zhì)、木質(zhì)素和單寧類物質(zhì)等有待以后進一步研究,以獲得更好、更密切的與抗性相關(guān)的生化指標(biāo)。

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