佘小漫, 何自福, 李華平, 虞 皓

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所,廣州 510640; 2.華南農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院,廣州 510642)

茄科雷爾氏菌[Ralstonia solanacearum(Smith)Yabuuchi et al.]是世界上最重要的植物病原細菌之一,廣泛分布于熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)。該病原細菌的寄主范圍很廣,可侵染55科數(shù)百種植物[1]。在我國,目前已報道有番茄、辣椒、茄子、馬鈴薯、煙草、花生、生姜、沙姜、桑、空心菜和桉樹等 10余種作物受到該病原細菌的危害。

茄科雷爾氏菌種內(nèi)存在明顯生理分化和遺傳差異。根據(jù)對不同寄主植物種類的致病性不同,將該病原細菌其劃分為5個生理小種(race)[2-4];而根據(jù)菌株對3種二糖和3種己醇氧化能力的差異,又可以將其劃分為6個生化變種(biovar)[3,5-6]。Li等[7]通過對16Sr RNA基因序列分析將茄科雷爾氏菌分為2個簇(或亞種),并與 Cook等[8]的 2個區(qū)組(division)相對應。另外,分子系統(tǒng)進化分析還可以將該病原細菌區(qū)分為亞洲組(Asiaticum)、美洲組(Americanum)和非洲亞組(African subdivision)等3個地理組[9-11]。因此,分類意義上的茄科雷爾氏菌明顯是一個復合種。

對于茄科雷爾氏菌這個復合種,不同來源,尤其是不同寄主植物來源的菌株間系統(tǒng)進化在分子水平上有無差異?先前的研究結(jié)果顯示,不同地理區(qū)域和寄主植物來源的茄科雷爾氏菌菌株存在豐富的遺傳多樣性[12-13],但其16S rDNA十分保守[14]。在茄科雷爾氏菌的分類與系統(tǒng)進化研究時,16S-23S rDNA ITS序列分析可以作為16S rDNA序列分析的補充[15]。因此,本文通過對來源于12種寄主植物的茄科雷爾氏菌代表菌株的16S-23S rRNA基因間隔區(qū)序列的研究,進一步探討這些不同寄主來源菌株的分子特征,全面認識該病原菌的生理分化和遺傳變異,為控制該病原菌的危害奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株共21株,分別分離自廣東不同寄主植物,并鑒定其所屬生化變種[16](表1)。所有菌株均在含2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)平板培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)3 d。選取白邊寬中間粉紅色的單菌落用于試驗。

表1 供試的21個茄科雷爾氏菌菌株

1.2 菌株基因組DNA的提取

按Boucher等[17]方法提取各菌株基因組DNA。

1.3 PCR引物

用原核生物16S-23S rDNA ITS通用引物[18]進行 PCR,其序列為:1493f(5′-AGTCGTAACAAGGTAGCCGT-3′)和 23r(5′-GTGCCAAGGCATCCACC-3′)。上述引物均由上海生工生物技術(shù)工程服務有限公司合成。

1.4 PCR擴增體系

以提取的基因組DNA為模板進行擴增。PCR反應體系(25μL)含如下成分:DNA模板約 20～25 ng,10×PCR buffer 2.5μL,dNTPs 200μmol/L,2個引物各0.4μmol/L和3 U Taq酶(TaKaRa)。PCR擴增條件為:94℃預變性4 min,之后94℃變性30 s,48℃退火30 s,72℃延伸1 min,30個循環(huán),72℃最終延伸10 min。PCR反應結(jié)束后,取6μL擴增產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳,用全自動凝膠成像系統(tǒng)(SYNGENE公司)觀察和分析電泳結(jié)果。

1.5 序列分析

對PCR擴增獲得的茄科雷爾氏菌21個株菌16S-23SrDNA ITS進行雙向測序,以獲得各菌株全序列,并將這些序列分別與19個茄科雷爾氏菌菌株、2個 blood disease bacterium(BDB)菌株(表 2)的16S-23S rDNA ITS進行比較分析,應用DNAstar 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表2 參與分析的茄科雷爾氏菌和BDB菌株及其16S-23Sr DNA ITS序列1)

2 結(jié)果分析

2.1 PCR擴增16S-23Sr DNA ITS序列結(jié)果

應用原核生物通用引物23r和1 493f分別對21個茄科雷爾氏菌菌株進行PCR擴增,其產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示,從21個菌株基因組DNA中均能成功地擴增出約590 bp特異片段,與預期片段大小一致(圖 1)。

圖1 PCR擴增21個菌株16S-23Sr DNA ITS的產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 16S-23SrDNA ITS序列分析結(jié)果

對21個菌株P(guān)CR產(chǎn)物進行雙向測序,將測序結(jié)果進行拼接,結(jié)果表明:除菌株HZ-1擴增的片段長度為586 bp(GenBank登錄號:FJ744134)外,其他20個菌株擴增的片段大小均為591 bp(GenBank登錄號見圖2)。去除兩端16S rDNA和23 rDNA序列,菌株HZ-1的ITS序列長度為498 bp,其他20個菌株的ITS序列全長均為503 bp。

序列比較結(jié)果顯示,21個菌株之間ITS序列相似性最高為100%,最低為95.4%;菌株HZ-1與R.solanacearum GMI1000的16S-23SrDNA ITS序列相似性為 95.8%,而其他 20個菌株序列與 R.solanacearum GMI1000的16S-23SrDNA ITS序列相似性均大于99.2%(表3)。進一步比對發(fā)現(xiàn),菌株HZ-1與其他20個菌株分別有33～37 bp不等的堿基差異;在其余20個菌株中,菌株 DG-2、HZ-2、GY-2 、RR-1 、RR-2 、NX-1 、NX-5 、PY-10 、GY0501 和FC-1 之間 ,菌株 GY-1、LZ-3、YC-33 、ZCZ-2、MA 和PC之間,以及菌株 YC-5、CW-1和CW-10之間,其ITS序列均完全一致,其余菌株間也僅有1～4個不等的堿基差異。

根據(jù)21個菌株以及來源于GenBank的22個菌株(包括 P.pickettii外圍菌株)16S-23S rDNA ITS,利用DNAstar軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果顯示:40個茄科雷爾氏菌株、2個BDB菌株共42個菌株可聚類為3個分支,其中第1分支包含了生化變種Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ菌株,對應于Li等[7]的茄科雷爾氏菌區(qū)組1;第2分支包含了生化變種Ⅰ和Ⅱ菌株,對應于Li等[7]的茄科雷爾氏菌區(qū)組2;兩個BDB菌株自成一個分支。本研究的21個菌株中,只有菌株HZ-1聚類在區(qū)組2,其余20個菌株聚類在區(qū)組 1(圖 2)。

表3 21株茄科雷爾氏菌16S-23S rDNA ITS的序列相似性比較 %

續(xù)表3%

圖2 茄科雷爾氏菌及相關(guān)菌株的16S-23Sr DNA ITS系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

16S-23S rDNA ITS序列的進化速度是16S rDNA的10倍[19],該區(qū)間經(jīng)常有序列的缺失和插入,造成不同種和同種不同菌株的16S-23S rDNA ITS在數(shù)目、長度和序列組成上的異質(zhì)性。因此,在細菌分類、系統(tǒng)進化和分子特征等研究中,16S-23S rDNA ITS序列分析具有重要價值。

本研究分析了來源于12種寄主植物21株茄科雷爾氏菌的16S-23S rDNA ITS全長序列,除菌株HZ-1外,其余20個菌株的序列長均為503 bp,序列間相似性為99.2%～100%;而HZ-1菌株的序列長為498 bp,與其他 20個菌株間的序列相似性為95.4%～95.6%。所有菌株 ITS序列所包含的tRNAala和 tRNAile核苷酸序列完全一樣,高度保守。因此,來源于不同寄主植物的茄科雷爾氏菌菌株間的16S-23S rDNA ITS序列也十分保守。

本研究21個菌株中,僅HZ-1菌株屬生化變種Ⅱ,并與已登錄GenBank的茄科雷爾氏菌生化變種Ⅰ、Ⅱ菌株聚類在區(qū)組2分支中;而其余20個菌株分別屬生化變種Ⅲ和Ⅳ,且與已登錄GenBank的茄科雷爾氏菌生化變種Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ各菌株聚類在區(qū)組1分支中。由此可見,茄科雷爾氏菌的生化變種與區(qū)組間存在對應關(guān)系。這與對16S rDNA分析結(jié)果一致[16]。茄科雷爾氏菌種內(nèi)以及一些關(guān)系密切的相關(guān)菌如 blood disease bacterium(BDB)的 16S rRNA基因的序列高度相似,有時也難以區(qū)分[8-9]。但利用ITS序列,BDB菌自成一個分支,可以將其與茄科雷爾氏菌分開。

對于分離自廣東惠州馬鈴薯上的茄科雷爾氏菌菌株 HZ-1,其16S-23S rDNA ITS與 HZ-2及其他茄科雷爾氏菌菌株均存在較大差異,推測該菌株與其他20個菌株的起源不同。16S-23S rDNA ITS系統(tǒng)進化分析也支持這一推測,即HZ-1菌株屬于茄科雷爾氏菌區(qū)組2,而其他20個菌株均屬于茄科雷爾氏菌區(qū)組1。但該菌株的真正起源及與其他菌株間致病性差異等還有待于進一步研究。

[1] Hayward A C.Biology and epidemiology of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum[J].Annual Review Phytopathology,1991,29:65-87.

[2] Buddenhgen I,Sequeira L,Kelman A.Designation of races in Pseudomonassolanacearum[J].Phytopathology,1962,52:726.

[3] He L Y,Sequeira L,Kelman A.Characteristics of strains of Pseudomonassolanacearum[J].Plant Dis,1983,67:1357-1361.

[4] Pegg K,Moffett M.Host range of the ginger strain of Pseudomonas solanacear um in Queensland[J].Aust J Ex p Agric Anim Husb,1971,11:696-698.

[5] Hayward A C.Characteristics of Pseudomonassolanacearum[J].Journal of Applied Bacteriology,1964,27:265-277.

[6] Hayward A C,El-Nashaar H M,Nydegger U,et al.Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacear um[J].J Appl Bacteriol,1990,69:269-280.

[7] Li X,Dorsch M,Del Dot T,et al.Phylogenetic studies of the rRNA group II pseudomonads based on 16S r RNA gene sequences[J].Journal of Applied Bacteriology,1993,74:324-329.

[8] Cook D,Barlow E,Sequeira L.Genetic diversity of Pseud omonas solanacear um:detection of restriction fragment length polymorphisms that specify virulence and the hypersensitive response[J].Molecular Plant-Microbe Interactions,1989,2:113-121.

[9] Cook D,Barlow E,Sequeira L.Genetic diversity of Pseud omonas solanacear um:detection of restriction fragment length polymorphisms that specify virulence and the hypersensitive response[J].Molecular Plant-Microbe Interactions,1989,2:113-121.

[10]Taghavi M,Hayward A C,Lindsay I et al.Analysis of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum,Pseudomonas syzy gii,and the blood disease bacterium of banana based on 16S r RNA gene sequence[J].International Journal of Systematic Bacteriology,1996,46:10-15

[11]Poussier S,Trigalet-Demery D,Vandewalle P,et al.Genetic diversity of Ralstonia solanacear um as assessed by PCR-RFLP of the hr p gene region,AFLPand 16S r RNA sequence analysis and identification of an African subdivision[J].Microbiology,2000,146:1679-1692.

[12]何自福,虞皓,羅方芳.廣東茄科青枯菌致病力分化及其 DNA多態(tài)性分析[J].植物病理學報,2003,33(5):415-420.

[13]陳永芳,何禮遠,等.我國植物青枯菌菌株的遺傳多樣性和組群劃分[J].植物病理學報,2003,33(6):503-508.

[14]佘小漫,何自福,虞皓,等.廣東茄科雷爾氏菌16S r DNA序列分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報,2009,30(4):24-28.

[15]Pastrik K H,Elphinstone J G,Pukall R.Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacear um by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control[J].European Journal of Plant Pathology,2002,108:831-842

[16]佘小漫,何自福,李華平,等.廣東茄科雷爾氏菌菌株生化變種的測定[G]∥中國植物病理學會2008年學術(shù)年會論文集.北京:中國農(nóng)業(yè)科學技術(shù)出版社,2008:337-339.

[17]Boucher C A,Van Gijsegem F,Barberis P A,et al.Pseud omonas solanacear um genes controlling both pathogenicity on tomato and hy persensitivity on tobacco are clustered[J].Journal Bacteriology,1987,169:5626-5632.

[18] Li Xiang,De Boer SH.Selection of polymerase chain reaction primers from an RNA intergenic spacer region for specific detection of Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus[J].Phytopathology,1995,85:837-842.

[19]鄭雪松,楊虹,李道棠,等.基因間隔序列(ITS)在細菌分類鑒定和種群分析中的應用[J].應用與環(huán)境生物學報,2003,9(6):678-684.