陶 晶, 李 暉, 李 春,2*

(1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆兵團(tuán)化工綠色過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子 832003;2.北京理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物工程系,北京 100081)

在長期的研究和生產(chǎn)實(shí)踐中,人們發(fā)現(xiàn)在植物根際存在著許多對作物病害有良好控制效果的微生物,有些根際微生物還具有促進(jìn)植株生長和提高營養(yǎng)利用率的作用[1-3]。然而受生物及非生物因素的影響,單種生防菌在復(fù)雜的根圍及土壤條件下防病效果通常不太穩(wěn)定,而且很多生防功能不是單株生防菌能完成的,必須依靠兩種或兩種以上的微生物共同完成,借助多種微生物的復(fù)合作用創(chuàng)造一個有利于寄主而不利于病害發(fā)展的生態(tài)環(huán)境,以更好地實(shí)現(xiàn)綜合防治[4-5]。因此,利用生防菌的混合菌劑防治植物病害,挖掘并利用其功能已成了植物病害生物防治的研究熱點(diǎn)[6-8]。本研究以具有顯著促生功能的芽胞桿菌SL-44[9]與具有顯著抗病效果的芽胞桿菌SL-13和SL-14[10]復(fù)配而成的組合BCL-8為對象,研究了其促生防病效果并初步探索了其促生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株及植物品種

單一芽胞桿菌SL-13、SL-14和SL-44均為新疆兵團(tuán)化工綠色過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自新疆特殊生態(tài)環(huán)境下分離篩選獲得,這3株芽胞桿菌以2∶1∶2的比例組合為BCL-8。植物病原真菌立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)自番茄病株根部分離純化獲得。植物品種為新疆加工番茄主栽品種里格爾87-5。

1.1.2 培養(yǎng)基

薩氏葡萄糖培養(yǎng)基(SDAY)[11]作為種子培養(yǎng)基擴(kuò)繁和傳代培養(yǎng)芽胞桿菌,馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基[12](PDA)用于室內(nèi)培養(yǎng)病原菌立枯絲核菌,麥麩培養(yǎng)基(麥麩與水的體積比為1∶1,每kg麥麩中含葡萄糖20 g,121℃滅菌60 min)用于立枯絲核菌的擴(kuò)繁。

1.2 芽胞桿菌組合BCL-8促生防病效果的測定

分別用芽胞桿菌組合BCL-8及其單一菌株的發(fā)酵液(含菌量1011cfu/mL)浸泡番茄種子12 h,晾干后均勻置于鋪有3層潤濕滅菌濾紙的托盤內(nèi),于25℃下培養(yǎng)。每24 h記錄發(fā)芽數(shù),6 d后分別測量各處理的芽長、根長及鮮重,以滅菌培養(yǎng)液浸種為對照,每處理重復(fù)5次。

病原菌立枯絲核菌用麥麩培養(yǎng)基擴(kuò)繁,接種培養(yǎng)5～7 d后與滅菌土以1∶8的體積比充分混勻裝入營養(yǎng)缽中。分別用芽胞桿菌組合BCL-8及其單一菌株的發(fā)酵液(含菌量1011cfu/mL)浸泡番茄種子,浸泡12 h晾干后均勻播入營養(yǎng)缽中,每缽20粒種子,每處理重復(fù)5次,設(shè)3個對照,CK 1:滅菌培養(yǎng)液浸種,土壤接種絲核菌;CK2:滅菌培養(yǎng)液浸種,土壤為滅菌土;CK 3:用種子重量0.8%的化學(xué)農(nóng)藥五氯硝基苯(簡稱PCNB,70%粉劑)拌種,土壤接種絲核菌。定期澆水,種子出苗后15 d調(diào)查出苗率和發(fā)病情況。播種35 d后測各處理的植株株高、鮮重和干重。

發(fā)病率=(發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù))×100%,病情指數(shù)=[(各級發(fā)病株數(shù)×各自級數(shù)的總和)/(最高發(fā)病級數(shù) ×調(diào)查總株數(shù))]×100,防治效果=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100%。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2003和SAS(v8)軟件分析,Excel 2003軟件作圖。

1.3 芽胞桿菌組合BCL-8的促生機(jī)制

1.3.1 發(fā)芽種子蛋白酶的測定

種子處理同1.2,稱取2 g處理過的番茄種子,用20 mL磷酸緩沖液冰浴研磨,8 000 g冷凍離心15 min后上清液即為蛋白酶粗提液,將粗酶液在沸水浴中處理5 min使酶失活作為對照。采用福林-酚試劑法[13],于721分光光度計(jì)測定 A680的吸光度值,從酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線中找出相應(yīng)的酪氨酸的微摩爾數(shù),蛋白酶活力以水解產(chǎn)生的酪氨酸含量來表示,每處理重復(fù)3次。

1.3.2 發(fā)芽種子α-淀粉酶和β-淀粉酶的測定

種子處理同1.2,種子萌發(fā)3 d后每處理參照李合生[13]的方法,活性測定采用3,5-二硝基水楊酸比色法,于721分光光度計(jì)測定A540的吸光度值,根據(jù)吸光值在麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的麥芽糖含量(mg),分別計(jì)算出總淀粉酶活性和α-淀粉酶活性,最后算出β-淀粉酶活性大小,用mg/(g·min)表示,每處理重復(fù)3次。

1.3.3 電導(dǎo)法測定種子的活力

每處理選取大小一致且無機(jī)械損傷的番茄種子20粒,分別裝入加有10 mL BCL-8及其單一菌株菌懸液(濃度為1011cfu/mL)的三角瓶里,對照瓶加入10 mL雙蒸水,于25℃浸泡。測定零時刻浸泡液的電導(dǎo)率作為初始值(a1),浸泡 8 h后(種子充分吸脹),測定浸泡液的電導(dǎo)率(a2)。然后將種子及其浸泡液置于 100℃水浴中煮沸60 min,取出冷卻至25℃,測煮沸后種子浸泡液的電導(dǎo)率(a3),每處理重復(fù)3次。

種子的相對電導(dǎo)率(%)=(a2-a1)×100/(a3-a1)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽胞桿菌組合BCL-8對番茄的促生防病效果

室內(nèi)測定了芽胞桿菌組合BCL-8及其單一菌株對番茄發(fā)芽的促生效果(表1)。結(jié)果表明,各處理都可促進(jìn)番茄幼芽的生長。芽胞桿菌組合BCL-8可提前1 d發(fā)芽,經(jīng)其處理的芽鮮重比對照增加了37.5%,平均根長和芽長分別比對照高69.89%和27.05%,根芽比也高于對照,更有利于植株后期健康生長。

表1 芽胞桿菌組合BCL-8對番茄發(fā)芽的促生效果1)

芽胞桿菌組合BCL-8及其單一菌株對苗期番茄的室內(nèi)抗病效果見表2,從表中數(shù)據(jù)可以看出當(dāng)病原菌番茄立枯絲核菌存在時,組合BCL-8及其單一菌株都能提高番茄種子的出苗率,促進(jìn)番茄苗期的生長,又可顯著抑制病原菌,降低番茄苗期立枯病的發(fā)病率。組合BCL-8的促生防病效果尤其顯著,其出苗率、株高、鮮重和干重分別比 CK 1高 21.67%、117.08%、125.74%和140.51%,對番茄立枯病的防治效果可達(dá)58.62%,而PCNB的防效僅為12.62%。由此可見,芽胞桿菌組合BCL-8具有促生和防病雙重功效。

表2 芽胞桿菌組合BCL-8對番茄苗期促生防病效果的測定1)

2.2 芽胞桿菌組合BCL-8對種子發(fā)芽的促生機(jī)制

2.2.1發(fā)芽種子蛋白酶的活性變化

發(fā)芽種子蛋白酶活性的測定結(jié)果如圖1。由圖可知,經(jīng)芽胞桿菌組合BCL-8及其單一菌株處理過的番茄種子蛋白酶活性高于未處理過的種子,組合BCL-8處理的蛋白酶活性比對照高299.91%,其中SL-14處理的蛋白酶活性最高,比對照高479.87%。可見這些芽胞桿菌有助于增強(qiáng)種子活力。

圖1 番茄發(fā)芽種子蛋白酶活性的比較

2.2.2 發(fā)芽種子α-和β-淀粉酶的活性變化

發(fā)芽種子α-淀粉酶和β-淀粉酶活性的測定結(jié)果如圖2(a)和(b)。由圖可知,經(jīng)芽胞桿菌組合BCL-8及其單一菌株處理的番茄種子α-淀粉酶活性均高于未處理的種子,β-淀粉酶活性除SL-14菌株處理之外也都高于對照。芽胞桿菌組合BCL-8處理的種子α-淀粉酶和β-淀粉酶活性分別比對照高96.74%和99.98%;其中SL-14處理的種子α-淀粉酶活性最高,比對照高483.70%,SL-13處理的種子α-淀粉酶活性最高,比對照高146.15%?？梢?芽胞桿菌處理番茄種子后,種子中淀粉轉(zhuǎn)化為糖類物質(zhì)的能力得到加強(qiáng),種子萌發(fā)能力增強(qiáng)。

2.2.3 電導(dǎo)法測定種子的活力

當(dāng)種子發(fā)生劣變時,其胞內(nèi)物質(zhì)外滲,導(dǎo)致其電導(dǎo)率的升高,從而使種子活力降低。本試驗(yàn)結(jié)果表明(見圖3),用芽胞桿菌組合BCL-8及其單一菌株處理的番茄種子的電導(dǎo)率都比對照低。組合BCL-8處理的種子電導(dǎo)率比對照低10.02%,其中SL-44處理的種子電導(dǎo)率比對照低10.55%?？梢?這些芽胞桿菌具有保持種子活力的作用。

3 討論

本研究對芽胞桿菌組合BCL-8和單一菌株的促生抗病效果進(jìn)行了比較研究。芽胞桿菌組合BCL-8及其單一菌株處理均可促進(jìn)種子發(fā)芽。芽胞桿菌組合BCL-8對苗期的促生抗病作用較單一菌株顯著。組合BCL-8處理后,番茄種子發(fā)芽率提高了12.5%,出苗率提高了41.92%,對番茄立枯病的防治效果達(dá)58.62%,這在實(shí)際生產(chǎn)中是很有應(yīng)用價值的。經(jīng)組合BCL-8及單一菌株處理過的番茄種子,其蛋白酶、α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性高于對照,而電導(dǎo)率低于對照。蛋白酶在種子萌發(fā)過程中能催化蛋白質(zhì)水解為氨基酸以供種子發(fā)育;α-淀粉酶和β-淀粉酶能夠促進(jìn)種子中的淀粉轉(zhuǎn)換成糖類等能源物質(zhì)供種子萌發(fā)過程使用;當(dāng)植物受逆境影響的時候,細(xì)胞膜受到破壞,膜透性增大,細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲,導(dǎo)致植物細(xì)胞浸提液的電導(dǎo)率增大,即電導(dǎo)率越高,種子活力越小。綜上所述,芽胞桿菌對種子發(fā)芽的促生機(jī)制,可能是不同芽胞桿菌的作用機(jī)制不同,產(chǎn)生的代謝物質(zhì)也不同,通過不同途徑增加了營養(yǎng)物質(zhì)的積累,提高了機(jī)體對有機(jī)物質(zhì)的利用率;其次,可能是不同微生物之間存在協(xié)同增效作用,協(xié)同抑制或減少病原菌的發(fā)生或繁衍,從而增強(qiáng)了植株的生長勢[15]。

盡管根際微生物的防病促生作用已成功地得到應(yīng)用,但關(guān)于其作用機(jī)制至今還不很清楚。本研究以體外抑菌試驗(yàn)篩選得到的具有顯著促生抗病作用的細(xì)菌組合為基礎(chǔ),對促生生防菌的促生抗病機(jī)制進(jìn)行了初步探索。在植物病害的生物防治中,將防病作用與促生作用相結(jié)合,可以相互促進(jìn),得到更加理想的效果。因此,在實(shí)踐中應(yīng)考慮把兩種功能有機(jī)地結(jié)合起來,篩選出既有防病作用又有促生作用的生防菌株,以達(dá)到既能防治病害又可促進(jìn)植物生長的目的。芽胞桿菌組合BCL-8顯著的促生抗病效果可能還存在其他促生抗病機(jī)制,尤其是多個菌株復(fù)配之后的協(xié)同增效機(jī)理十分復(fù)雜,還需進(jìn)行更深入的研究工作,以闡明其作用機(jī)制。

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