王 威,江海濤,史 紅,劉友剛,王 超,田 維,胡利民
(天津中醫(yī)藥大學(xué),教育部方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津市藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300193)
近年來(lái),隨著人們的生活水平的提高,飲食結(jié)構(gòu)和體力勞動(dòng)的變化,脂肪肝的發(fā)病率逐年上升。預(yù)防和治療脂肪肝已經(jīng)成為中西醫(yī)臨床和基礎(chǔ)研究的重要課題??偨Y(jié)張伯禮教授多年的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),疏肝導(dǎo)濁法治療脂肪肝具有很好的療效。本實(shí)驗(yàn)采用高脂飲食建造高脂血癥型脂肪肝動(dòng)物模型,以疏肝導(dǎo)濁方藥進(jìn)行治療,觀察肝組織轉(zhuǎn)氨酶、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)等含量的變化,從整體動(dòng)物水平上探討疏肝導(dǎo)濁方藥的抗氧化作用。
1.1 動(dòng)物 健康大耳白家兔60只,體質(zhì)量(2.3±
0.3 )kg,雄性,由天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代理購(gòu)進(jìn),飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,環(huán)境設(shè)施符合《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)》二級(jí)標(biāo)準(zhǔn),單籠飼養(yǎng),飼喂高脂飼料(除空白對(duì)照組外),自由飲水。
1.2 藥物 疏肝導(dǎo)濁方藥由柴胡、澤瀉、荷葉、丹參等中藥組成,具有清熱化濕、疏肝利膽的功效。干粉出膏率為20%,實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水配成1.6×103g/L、0.8×103g/L、0.4×103g/L 的溶液。陽(yáng)性對(duì)照藥東寶肝泰,實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水配成36.4 g/L的溶液。
1.3 試劑 轉(zhuǎn)氨酶試劑盒由北控生物科技股份有限公司購(gòu)入;超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒由北控生物科技股份有限公司購(gòu)入;丙二醛(MDA)試劑盒由北控生物科技股份有限公司購(gòu)入;其他藥品由天津市化學(xué)試劑公司購(gòu)進(jìn)。
1.4 儀器 半自動(dòng)生化儀(荷蘭威圖公司300型),自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京離心機(jī)廠LDZ5-2),數(shù)顯電子恒溫水浴(江蘇金華市醫(yī)療儀器廠),可調(diào)微量加樣器(Ependaff)。
2.1 模型建立及分組 60只大耳白家兔普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,耳緣靜脈取血,測(cè)定甘油三酯(TG)的含量,根據(jù)血清中TG值將家兔隨機(jī)分為2組:空白對(duì)照組10只、高脂高糖造模組50只??瞻讓?duì)照組繼續(xù)飼以普通飼料,高脂高糖造模組則給予高脂高糖飼料喂養(yǎng),高脂高糖飼料配方為豬油10%、膽固醇1%、蔗糖15%、74%基礎(chǔ)飼料及少量谷類組成。高脂高糖飼料飼養(yǎng)6周后,耳緣靜脈取血檢測(cè)血清TG的含量。根據(jù)TG值,將其隨機(jī)分為5組:模型組、導(dǎo)濁方生藥8 g/kg組、導(dǎo)濁方生藥4 g/kg組、導(dǎo)濁方生藥2 g/kg組、工具對(duì)照藥物——東寶肝泰組。給藥組按分組原則灌胃給藥5周,空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給等體積的蒸餾水。
2.2 分組給藥 模型成功后,按疏肝導(dǎo)濁方藥高劑量組8 g/(kg·d),疏肝導(dǎo)濁方藥中劑量組4 g/(kg·d),疏肝導(dǎo)濁方藥低劑量組2 g/(kg·d),東寶肝泰組0.18 k/(kg·d),灌胃給藥1次/d。模型組和空白對(duì)照組給等體積的蒸餾水,連續(xù)5周,自由飲食。彩超監(jiān)測(cè)脂肪肝情況直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束,麻醉取血,剖腹取肝組織測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。飼養(yǎng)和給藥過(guò)程中各組均有死亡,結(jié)果統(tǒng)計(jì) n=8。
2.3 觀察指標(biāo)及測(cè)定方法 稱體質(zhì)量,25%烏拉坦1 mL/kg腹腔注射麻醉,打開(kāi)腹腔,立即觀察肝臟色澤;腹主動(dòng)脈取血。3000 r/min離心,取血清檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。
生化檢測(cè):采用試劑盒檢測(cè)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)。
2.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,計(jì)量資料采用單因素方差分析。
3.1 動(dòng)物表現(xiàn) 空白對(duì)照組:兔毛光澤,體態(tài)活潑,反應(yīng)敏捷,食量糞便均正常。高脂造模組:造模開(kāi)始時(shí),兔毛光澤,體態(tài)活潑,反應(yīng)敏捷,食量糞便均正常。造模3周以后,出現(xiàn)兔毛凌亂,耳朵下垂,食量減少,精神不振,時(shí)有稀便。治療組:高脂造模家兔給予藥物治療后,食量有所增加,糞便逐漸出現(xiàn)正常,但總排便量增加。
3.2 肝臟形態(tài) 空白對(duì)照組家兔肝臟色澤暗紅,形態(tài)無(wú)明顯異常。模型組家兔肝臟包膜緊張,邊緣圓鈍,色澤橙黃,質(zhì)軟;切面油膩,呈豆腐渣樣改變,甚者呈奶黃色,見(jiàn)典型肝脂變。各治療組家兔肝臟色澤、質(zhì)地、外觀基本介于空白對(duì)照組與模型對(duì)照組之間。
3.3 血清轉(zhuǎn)氨酶的變化 給藥組的AST和ALT與模型組相比并沒(méi)有顯著性差異。而模型組的ALP含量高于空白對(duì)照組,模型組與低劑量組相比有顯著性差異(P<0.05)。
表1 各組家兔血清轉(zhuǎn)氨酶的變化(±sTab.1 The change of AST、ALT、ALP of each group(±sU/L
表1 各組家兔血清轉(zhuǎn)氨酶的變化(±sTab.1 The change of AST、ALT、ALP of each group(±sU/L
注:與模型組比較,△P<0.05。
組別空白對(duì)照組模型組東寶肝泰組疏肝導(dǎo)濁方藥組疏肝導(dǎo)濁方藥組疏肝導(dǎo)濁方藥組劑量g/(kg·d)--0.18842 n888888 AST 65.89±17.3469.70±13.1866.70±20.5169.10±23.2463.40±17.4367.00±22.46 ALT 52.20±21.2560.80±12.5756.70±12.3460.90±14.9353.60±13.8759.50±16.53 ALP 66.20±16.5571.80±17.0356.00±14.4463.40±19.0663.20±19.1050.40±15.03△
3.4 對(duì)家兔血清NO、SOD、MDA的影響 模型組與空白對(duì)照組相比,高脂飲食并沒(méi)有引起家兔血清中NO的增加,給藥組和模型組之間的NO水平并沒(méi)有顯著差異。而模型組的SOD水平下降(P<0.05),給予方藥治療后,中劑量及低劑量與模型組相比SOD水平都有不同程度的提高(P<0.01)。模型組MDA的含量明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01),高劑量組與模型組比較MDA含量顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表2。
表2 各組家兔血清NO、SOD、MDA的變化(±sTab.2 The changer of NO,SOD and MDA of each group(±s
表2 各組家兔血清NO、SOD、MDA的變化(±sTab.2 The changer of NO,SOD and MDA of each group(±s
注:與空白對(duì)照組比較,**P<0.01,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01。
劑量g/(kg·d)組別空白對(duì)照組模型組東寶肝泰組疏肝導(dǎo)濁方藥組疏肝導(dǎo)濁方藥組疏肝導(dǎo)濁方藥組--0.18842 n888888 NO(μmol/L)73.00±21.7280.25±16.8187.50±21.7065.75±6.7878.75±7.0976.75±15.05 SOD(kU/L)208.83±24.46156.15±36.13*184.37±26.12184.37±34.35228.59±46.94△△259.63±53.80△△MDA(mmol/L)1.69±0.909.53±1.81**8.45±1.914.69±0.82△10.30±2.9810.34±1.37
脂肪性肝病(FLD)簡(jiǎn)稱脂肪肝,是由多種疾病和病因引起的肝臟脂肪性改變。輕度的肝細(xì)胞脂肪變性在大體上可無(wú)明顯變化,但當(dāng)半數(shù)以上肝細(xì)胞有脂滴蓄積,或者肝內(nèi)蓄積脂肪含量超過(guò)肝濕質(zhì)量的5%,即形成脂肪肝。脂肪肝依據(jù)臨床表現(xiàn)可與中醫(yī)“痰濁”、“濕阻”、“脹滿”、“積證”、“脅痛”屬范疇。多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為,脂肪肝是由于飲食失節(jié),情志不暢,肝膽疏泄失常,脾失健運(yùn)不能升清降濁、輸布精微,致使痰濕淤阻,濁積于肝而成為脂肪肝。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,疏肝導(dǎo)濁方藥低劑量組與模型組比較ALP水平有所降低。堿性磷酸酶(ALP)是細(xì)胞膜結(jié)合酶,在某些化學(xué)物質(zhì)的誘導(dǎo)下,可使肝臟ALP合成增加。高脂血癥時(shí),脂肪酸合成增加,導(dǎo)致肝臟中乙酰CoA積累,繼而產(chǎn)生?;憠A等,從而誘導(dǎo)ALP合成增加。疏肝導(dǎo)濁方藥低劑量組ALP水平降低,可能是因?yàn)槭韪螌?dǎo)濁方藥可以降低血液中游離脂肪酸(FFA),導(dǎo)致肝臟中乙酰CoA積累減少,繼而使?;憠A產(chǎn)生減少,誘導(dǎo)減弱,ALP合成減少。提示:疏肝導(dǎo)濁方藥可以降低脂肪肝患者的ALP水平或許具有修復(fù)、保護(hù)肝細(xì)胞脂膜的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示:各給藥組、模型組與空白對(duì)照組比較AST、ALT水平?jīng)]有明顯變化。提示:疏肝導(dǎo)濁方藥和高脂造模飲食對(duì)家兔肝功能無(wú)損傷。
SOD、MDA含量的高低直接反應(yīng)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的強(qiáng)度和速率,一直作為自由基產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化損傷程度的重要指標(biāo)??寡趸瘜?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:血清中SOD的活性模型組明顯低于空白對(duì)照組(P<0.05),這表明脂肪肝疾患使SOD活性降低。而疏肝導(dǎo)濁方藥中、低劑量組與模型組相比能顯著提高SOD活性。提示:疏肝導(dǎo)濁方藥能提高SOD活性,利于清除體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物;血清中MDA的含量模型組明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01),表明模型組脂質(zhì)氧化損傷嚴(yán)重。疏肝導(dǎo)濁方藥高劑量與模型組比較能顯著降低MDA含量。提示:疏肝導(dǎo)濁方藥可抑制家兔肝細(xì)胞膜及內(nèi)膜系統(tǒng)中,多種自由基所致的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。降低MDA的含量可以抑制肝臟膠原纖維的增生[1]。這可能是其抗脂肪肝氧化損傷的機(jī)制之一。
NO模型組與空白對(duì)照組相比,高脂飲食并沒(méi)有引起家兔血清中NO的增加,給藥組和模型組之間的NO水平并沒(méi)有顯著差異。但各給藥組與模型組相比有降低的趨勢(shì)。
脂肪肝的病變?yōu)榭赡嫘圆∽?,在早期診斷和合理治療下可康復(fù)。但是如果不及時(shí)治療,部分脂肪肝患者可能發(fā)展為肝纖維化,甚至肝硬化[2]。西藥降脂雖有一定效果,但長(zhǎng)期服用有不良反應(yīng)[3],且停藥后血脂容易迅速回升。故迫切需要研發(fā)毒副作用小的抗脂肪肝天然藥物。本實(shí)驗(yàn)研究為研制安全、有效的抗脂肪肝的中藥做了一些基礎(chǔ)工作。
[1]劉永剛,陳厚昌,蔣毅萍.姜黃素抗肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2002,13(5):273-275.
[2]Farrell GC,I arter CA.Nonalcoholic fatty liver disease:from steatosis to cirrhosis[J].Hepatology,2006,43(Suppl 1):899-8112.
[3]Portincasa P,Orattagliano I,Palmieri V 0,et a1.Currentpharmacological treatment of nonalcoholic fatty liver[J].Curr Med Chem,2006,13(24):2889-2900.