王 威，江海濤，史 紅，劉友剛，王 超，田 維，胡利民

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，教育部方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津市藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300193）

近年來(lái)，隨著人們的生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)和體力勞動(dòng)的變化，脂肪肝的發(fā)病率逐年上升。預(yù)防和治療脂肪肝已經(jīng)成為中西醫(yī)臨床和基礎(chǔ)研究的重要課題?？偨Y(jié)張伯禮教授多年的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，疏肝導(dǎo)濁法治療脂肪肝具有很好的療效。本實(shí)驗(yàn)采用高脂飲食建造高脂血癥型脂肪肝動(dòng)物模型，以疏肝導(dǎo)濁方藥進(jìn)行治療，觀察肝組織轉(zhuǎn)氨酶、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）等含量的變化，從整體動(dòng)物水平上探討疏肝導(dǎo)濁方藥的抗氧化作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康大耳白家兔60只，體質(zhì)量（2.3±

0.3 ）kg，雄性，由天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代理購(gòu)進(jìn)，飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，環(huán)境設(shè)施符合《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)》二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，單籠飼養(yǎng)，飼喂高脂飼料（除空白對(duì)照組外），自由飲水。

1.2 藥物 疏肝導(dǎo)濁方藥由柴胡、澤瀉、荷葉、丹參等中藥組成，具有清熱化濕、疏肝利膽的功效。干粉出膏率為20%,實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水配成1.6×103g/L、0.8×103g/L、0.4×103g/L 的溶液。陽(yáng)性對(duì)照藥東寶肝泰，實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水配成36.4 g/L的溶液。

1.3 試劑 轉(zhuǎn)氨酶試劑盒由北控生物科技股份有限公司購(gòu)入；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒由北控生物科技股份有限公司購(gòu)入；丙二醛(MDA)試劑盒由北控生物科技股份有限公司購(gòu)入；其他藥品由天津市化學(xué)試劑公司購(gòu)進(jìn)。

1.4 儀器 半自動(dòng)生化儀（荷蘭威圖公司300型），自動(dòng)平衡離心機(jī)（北京離心機(jī)廠LDZ5-2），數(shù)顯電子恒溫水浴（江蘇金華市醫(yī)療儀器廠），可調(diào)微量加樣器（Ependaff）。

2 方法

2.1 模型建立及分組 60只大耳白家兔普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，耳緣靜脈取血，測(cè)定甘油三酯（TG）的含量，根據(jù)血清中TG值將家兔隨機(jī)分為2組：空白對(duì)照組10只、高脂高糖造模組50只?？瞻讓?duì)照組繼續(xù)飼以普通飼料，高脂高糖造模組則給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，高脂高糖飼料配方為豬油10%、膽固醇1%、蔗糖15%、74%基礎(chǔ)飼料及少量谷類組成。高脂高糖飼料飼養(yǎng)6周后，耳緣靜脈取血檢測(cè)血清TG的含量。根據(jù)TG值，將其隨機(jī)分為5組：模型組、導(dǎo)濁方生藥8 g/kg組、導(dǎo)濁方生藥4 g/kg組、導(dǎo)濁方生藥2 g/kg組、工具對(duì)照藥物——東寶肝泰組。給藥組按分組原則灌胃給藥5周，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給等體積的蒸餾水。

2.2 分組給藥 模型成功后，按疏肝導(dǎo)濁方藥高劑量組8 g/（kg·d），疏肝導(dǎo)濁方藥中劑量組4 g/（kg·d），疏肝導(dǎo)濁方藥低劑量組2 g/(kg·d)，東寶肝泰組0.18 k/（kg·d），灌胃給藥1次/d。模型組和空白對(duì)照組給等體積的蒸餾水，連續(xù)5周，自由飲食。彩超監(jiān)測(cè)脂肪肝情況直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，麻醉取血，剖腹取肝組織測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。飼養(yǎng)和給藥過(guò)程中各組均有死亡，結(jié)果統(tǒng)計(jì) n＝8。

2.3 觀察指標(biāo)及測(cè)定方法 稱體質(zhì)量，25%烏拉坦1 mL/kg腹腔注射麻醉，打開(kāi)腹腔，立即觀察肝臟色澤；腹主動(dòng)脈取血。3000 r/min離心，取血清檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

生化檢測(cè):采用試劑盒檢測(cè)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 動(dòng)物表現(xiàn) 空白對(duì)照組：兔毛光澤，體態(tài)活潑，反應(yīng)敏捷，食量糞便均正常。高脂造模組：造模開(kāi)始時(shí)，兔毛光澤，體態(tài)活潑，反應(yīng)敏捷，食量糞便均正常。造模3周以后，出現(xiàn)兔毛凌亂，耳朵下垂，食量減少，精神不振，時(shí)有稀便。治療組：高脂造模家兔給予藥物治療后，食量有所增加，糞便逐漸出現(xiàn)正常，但總排便量增加。

3.2 肝臟形態(tài) 空白對(duì)照組家兔肝臟色澤暗紅，形態(tài)無(wú)明顯異常。模型組家兔肝臟包膜緊張，邊緣圓鈍，色澤橙黃，質(zhì)軟；切面油膩，呈豆腐渣樣改變，甚者呈奶黃色，見(jiàn)典型肝脂變。各治療組家兔肝臟色澤、質(zhì)地、外觀基本介于空白對(duì)照組與模型對(duì)照組之間。

3.3 血清轉(zhuǎn)氨酶的變化 給藥組的AST和ALT與模型組相比并沒(méi)有顯著性差異。而模型組的ALP含量高于空白對(duì)照組，模型組與低劑量組相比有顯著性差異（P<0.05）。

表1 各組家兔血清轉(zhuǎn)氨酶的變化(±sTab.1 The change of AST、ALT、ALP of each group(±sU/L

表1 各組家兔血清轉(zhuǎn)氨酶的變化(±sTab.1 The change of AST、ALT、ALP of each group(±sU/L

注：與模型組比較，△P<0.05。

組別空白對(duì)照組模型組東寶肝泰組疏肝導(dǎo)濁方藥組疏肝導(dǎo)濁方藥組疏肝導(dǎo)濁方藥組劑量g/（kg·d）--0.18842 n888888 AST 65.89±17.3469.70±13.1866.70±20.5169.10±23.2463.40±17.4367.00±22.46 ALT 52.20±21.2560.80±12.5756.70±12.3460.90±14.9353.60±13.8759.50±16.53 ALP 66.20±16.5571.80±17.0356.00±14.4463.40±19.0663.20±19.1050.40±15.03△

3.4 對(duì)家兔血清NO、SOD、MDA的影響 模型組與空白對(duì)照組相比，高脂飲食并沒(méi)有引起家兔血清中NO的增加，給藥組和模型組之間的NO水平并沒(méi)有顯著差異。而模型組的SOD水平下降（P<0.05），給予方藥治療后，中劑量及低劑量與模型組相比SOD水平都有不同程度的提高（P<0.01）。模型組MDA的含量明顯高于空白對(duì)照組（P<0.01），高劑量組與模型組比較MDA含量顯著降低（P<0.01）。見(jiàn)表2。

表2 各組家兔血清NO、SOD、MDA的變化(±sTab.2 The changer of NO,SOD and MDA of each group(±s

表2 各組家兔血清NO、SOD、MDA的變化(±sTab.2 The changer of NO,SOD and MDA of each group(±s

注：與空白對(duì)照組比較，**P<0.01，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05,△△P<0.01。

劑量g/（kg·d）組別空白對(duì)照組模型組東寶肝泰組疏肝導(dǎo)濁方藥組疏肝導(dǎo)濁方藥組疏肝導(dǎo)濁方藥組--0.18842 n888888 NO(μmol/L)73.00±21.7280.25±16.8187.50±21.7065.75±6.7878.75±7.0976.75±15.05 SOD(kU/L)208.83±24.46156.15±36.13*184.37±26.12184.37±34.35228.59±46.94△△259.63±53.80△△MDA(mmol/L)1.69±0.909.53±1.81**8.45±1.914.69±0.82△10.30±2.9810.34±1.37

4 討論

脂肪性肝病(FLD)簡(jiǎn)稱脂肪肝，是由多種疾病和病因引起的肝臟脂肪性改變。輕度的肝細(xì)胞脂肪變性在大體上可無(wú)明顯變化，但當(dāng)半數(shù)以上肝細(xì)胞有脂滴蓄積，或者肝內(nèi)蓄積脂肪含量超過(guò)肝濕質(zhì)量的5%，即形成脂肪肝。脂肪肝依據(jù)臨床表現(xiàn)可與中醫(yī)“痰濁”、“濕阻”、“脹滿”、“積證”、“脅痛”屬范疇。多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為，脂肪肝是由于飲食失節(jié)，情志不暢，肝膽疏泄失常，脾失健運(yùn)不能升清降濁、輸布精微，致使痰濕淤阻，濁積于肝而成為脂肪肝。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，疏肝導(dǎo)濁方藥低劑量組與模型組比較ALP水平有所降低。堿性磷酸酶（ALP）是細(xì)胞膜結(jié)合酶，在某些化學(xué)物質(zhì)的誘導(dǎo)下，可使肝臟ALP合成增加。高脂血癥時(shí)，脂肪酸合成增加，導(dǎo)致肝臟中乙酰CoA積累，繼而產(chǎn)生?；憠A等，從而誘導(dǎo)ALP合成增加。疏肝導(dǎo)濁方藥低劑量組ALP水平降低，可能是因?yàn)槭韪螌?dǎo)濁方藥可以降低血液中游離脂肪酸（FFA），導(dǎo)致肝臟中乙酰CoA積累減少，繼而使?；憠A產(chǎn)生減少，誘導(dǎo)減弱，ALP合成減少。提示：疏肝導(dǎo)濁方藥可以降低脂肪肝患者的ALP水平或許具有修復(fù)、保護(hù)肝細(xì)胞脂膜的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示：各給藥組、模型組與空白對(duì)照組比較AST、ALT水平?jīng)]有明顯變化。提示：疏肝導(dǎo)濁方藥和高脂造模飲食對(duì)家兔肝功能無(wú)損傷。

SOD、MDA含量的高低直接反應(yīng)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的強(qiáng)度和速率，一直作為自由基產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化損傷程度的重要指標(biāo)?？寡趸瘜?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：血清中SOD的活性模型組明顯低于空白對(duì)照組（P<0.05），這表明脂肪肝疾患使SOD活性降低。而疏肝導(dǎo)濁方藥中、低劑量組與模型組相比能顯著提高SOD活性。提示：疏肝導(dǎo)濁方藥能提高SOD活性，利于清除體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物；血清中MDA的含量模型組明顯高于空白對(duì)照組（P<0.01），表明模型組脂質(zhì)氧化損傷嚴(yán)重。疏肝導(dǎo)濁方藥高劑量與模型組比較能顯著降低MDA含量。提示：疏肝導(dǎo)濁方藥可抑制家兔肝細(xì)胞膜及內(nèi)膜系統(tǒng)中，多種自由基所致的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。降低MDA的含量可以抑制肝臟膠原纖維的增生[1]。這可能是其抗脂肪肝氧化損傷的機(jī)制之一。

NO模型組與空白對(duì)照組相比，高脂飲食并沒(méi)有引起家兔血清中NO的增加，給藥組和模型組之間的NO水平并沒(méi)有顯著差異。但各給藥組與模型組相比有降低的趨勢(shì)。

脂肪肝的病變?yōu)榭赡嫘圆∽?，在早期診斷和合理治療下可康復(fù)。但是如果不及時(shí)治療，部分脂肪肝患者可能發(fā)展為肝纖維化，甚至肝硬化[2]。西藥降脂雖有一定效果，但長(zhǎng)期服用有不良反應(yīng)[3]，且停藥后血脂容易迅速回升。故迫切需要研發(fā)毒副作用小的抗脂肪肝天然藥物。本實(shí)驗(yàn)研究為研制安全、有效的抗脂肪肝的中藥做了一些基礎(chǔ)工作。

[1]劉永剛，陳厚昌，蔣毅萍.姜黃素抗肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2002，13(5)：273-275.

[2]Farrell GC，I arter CA.Nonalcoholic fatty liver disease：from steatosis to cirrhosis[J].Hepatology，2006，43(Suppl 1)：899-8112.

[3]Portincasa P，Orattagliano I，Palmieri V 0，et a1.Currentpharmacological treatment of nonalcoholic fatty liver[J].Curr Med Chem，2006，13(24)：2889-2900.