蔡 青 ，張伯禮 ，黃淑蕓 ，汪 濤 ，譚俊珍 ，周 濤 ，李春深

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

谷氨酸（Glu）和 γ-氨基丁酸（GABA）是腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在突觸傳遞中起著重要的角色。已有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷可導(dǎo)致大鼠腦內(nèi)Glu/GABA比例失衡[1]。本研究通過建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，觀察丹參酮B鈉鹽對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠海馬內(nèi)Glu和GABA等神經(jīng)遞質(zhì)濃度的變化。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型制作

1.1.1 動物的分組及給藥方式 Wistar雄性大鼠體質(zhì)量280～350 g，天津中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，隨機分為5組，每組6只，分別為：偽手術(shù)組（Sham）、模型組（I/R）、丹參酮B鈉鹽（西安博勝生物科技有限公司）低劑量組（I/R+DT1，4 mg/kg）、中劑量組（I/R+DT2，8 mg/kg）、高劑量組（I/R+DT3，16 mg/kg）。各組于手術(shù)前3 d每天腹腔注射給藥1次，連續(xù)3 d，末次給藥30 min后，制備大鼠大腦中動脈閉塞再灌注模型（MCAO）后連續(xù)給藥兩次，其中偽手術(shù)組和模型組每天靜脈注射等體積生理鹽水。采用Zea-Long法[2]制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，假手術(shù)組除不進線外,其余過程同缺血組。再灌注組在缺血2 h后輕輕抽出魚線,使之退出到頸總動脈剪口處即可。手術(shù)過程中大鼠體溫維持在（37±0.5）℃，再灌注24 h后取材。

1.2 溶液配制

1.2.1 衍生化試劑 稱取100 mg鄰苯二甲醛（OPA）置于2 mL甲醇中，充分溶解后加入β-巰基乙醇 60 μL，再加 0.4 mol/L 硼酸緩沖液（pH 9.5）至10 mL，避光 4℃冷藏備用。每次過夜加 20 μL，β-巰基乙醇，可用7 d。

1.2.2 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的配制 準(zhǔn)確稱量氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（美國Sigma公司），用50%的甲醇水定容至10 mL棕色瓶中作為貯備液。為1 g/L，4℃貯存。

1.2.3 梯度洗脫液的配制 A相：0.03 mol/L乙酸鈉溶液，B 相：甲醇/0.1 mol/L 乙酸鈉溶液（4∶1），0.45 μm微孔濾膜過濾，超聲脫氣備用。

1.3 取材、樣品制備 各組大鼠，用20%氨基甲酸乙酯（1～2 g/kg）腹腔麻醉后，快速斷頭，低溫條件下，剝離雙側(cè)海馬，收集于1.5 mL離心管內(nèi)并標(biāo)記，置-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。取海馬約50 mg，加200 μL無水乙醇在冰臺上磨成勻漿，吸出200 μL勻漿液，在15700 r/min、4 ℃條件下離心 20 min，取 80 μL 上清液測定氨基酸含量。

1.4 衍生化反應(yīng) 吸取40 μL氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液或腦組織上清液，加入20 μL衍生化試劑，反應(yīng)1 min后立即進樣，進樣量為25 μL。

1.5 色譜條件 色譜柱：大連依利特Hypersil ODS C18（4.6×200 mm，5 μm）；流動相：A 為 0.03 mol/L 的醋酸鈉緩沖液（pH＝7.2），B 相：甲醇/0.1mol/L 乙酸鈉溶液，梯度洗脫程序見表1。流速：1 mL/min，檢測波長：335 nm；柱溫：35℃。取25 μL進樣分析，采用外標(biāo)法定量。將衍生好的樣品用微量進樣器加入高效液相色譜儀（HP1100，Agilent，USA），并用高效液相色譜工作站LCsolution記錄數(shù)據(jù)。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 The gradient of mobile phase%

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線 將氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋為1～8號工作液，依次進樣，用高效液相色譜儀檢測。在上述色譜條件下，兩種氨基酸得到有效分離，保留時間分別為：Glu（9.093 min），GABA（21.245 min），圖1為標(biāo)準(zhǔn)品1-4號工作液所得色譜圖，保留時間基本一致，重現(xiàn)性良好。兩種氨基酸在0.017～5 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)Glu為0.99987，GABA為r=0.9993，得出回歸方程如下：GLU：f=-39.8113+21132.7545x，GABA：f=-53.8116+8691.631 0x。

1.7 樣品測定 經(jīng)衍生化反應(yīng)的各組樣品按1.5色譜條件進行檢測，用已知的各標(biāo)準(zhǔn)品氨基酸色譜峰保留時間與腦組織勻漿上清液的色譜峰保留時間對照定性，并精密度實驗和回收率實驗（結(jié)果未顯示）。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 記錄到的數(shù)據(jù)，用HP1100高效液相色譜工作站LCsolution分析后，分別得到Glu和GABA的峰面積，將峰面積分別帶入回歸方程，可得到Glu和GABA的相對濃度。定量方法：用外標(biāo)法將三種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰面積值按以下公式進行換算：C=R1/R2×D ×N，式中：R1=待測樣品的峰面積；R2=氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品峰面積；D=氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度（g/L）；N=稀釋倍數(shù)；C=待測樣品濃度（g/L），最終計算海馬組織中兩種氨基酸的含量。所得到的數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，顯著性水平為 P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮B鈉鹽腦缺血再灌注大鼠海馬谷氨酸含量的影響 圖2為典型的海馬組織勻漿高效液相圖片，各組谷氨酸含量如表所示（表2）。假手術(shù)組（Sham）谷氨酸含量顯著低于其他各組（P<0.01）。腦缺血對照組（I/R）谷氨酸含量顯著高于丹參酮B鈉鹽各組（P<0.01）。丹參酮B鈉鹽高劑量組（I/R+T3）谷氨酸含量顯著低于丹參酮B鈉鹽低劑量組（I/R+T1）、中劑量組（I/R+T2）（P<0.01）。

2.2 丹參酮B鈉鹽腦缺血再灌注大鼠海馬GABA含量的影響 圖2為典型的海馬組織勻漿高效液相圖片，各組GABA含量如表3所示。假手術(shù)組（Sham）GABA含量顯著低于腦缺血對照組（I/R）、丹參酮 B鈉鹽低劑量組（I/R+T1）和中劑量組（I/R+T2）（P<0.01）。丹參酮B鈉鹽高劑量組（I/R+T3）GABA含量顯著低于腦缺血對照組（I/R）、丹參酮B鈉鹽低劑量組（I/R+T1）和中劑量組（I/R+T2）（P<0.01）。丹參酮 B 鈉鹽低劑量組（I/R+T1）、中劑量組（I/R+T2）GABA含量低于腦缺血對照組（I/R），但無顯著差異。

表2 不同組大鼠海馬組織谷氨酸含量Tab.2 Glutamate content in rat hippocampus of different groups(n=6)mg/g

表3 不同組大鼠海馬組織GABA含量Tabl.3 GABA content in rat hippocampus of different groups mg/g

3 討論

近年來的研究表明，中樞高濃度的Glu水平會導(dǎo)致神經(jīng)細胞的死亡。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦缺血/再灌注可以導(dǎo)致海馬的Glu濃度上升，細胞外的Glu富集，可能通過改變突觸后NMDA受體的活性上調(diào)，引起大量Ca2+內(nèi)流引起急性的滲透性損傷和慢性的氧化損傷，而導(dǎo)致海馬神經(jīng)細胞的丟失，海馬的形態(tài)學(xué)損傷。因此，腦缺血/再灌注引起的海馬內(nèi)Glu濃度的升高，這可能造成海馬神經(jīng)細胞的興奮性毒性損傷，也可能是海馬損傷的基礎(chǔ)，是海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶能力下降的神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)基礎(chǔ)。

興奮性氨基酸與抑制性氨基酸的失衡，對激發(fā)興奮毒性起一定作用，是腦組織缺血后再灌注過程的主要分子機制之一。在腦組織中，GABA與Glu是一對重要的抑制與興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，兩者的平衡對維持腦功能至關(guān)重要。GABA含量的增加對興奮性和抑制性傳遞的平衡起著關(guān)鍵作用，可能通過突觸后膜超極化，減少鈣內(nèi)流，降低細胞代謝使突觸后神經(jīng)元處于保護性抑制狀態(tài)，并通過突觸前抑制減少興奮性氨基酸遞質(zhì)釋放，減少低灌注區(qū)神經(jīng)元細胞死亡，進而間接導(dǎo)致對缺血性腦損傷的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生特殊影響，從而對抗興奮性氨基酸的毒性作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，Glu/GABA比值的變化可在一定程度上反應(yīng)腦內(nèi)氨基酸遞質(zhì)的平衡情況，并影響到神經(jīng)生理功能的變化[9]。腦缺血/再灌注引起的谷氨酸含量的升高，同時導(dǎo)致的海馬GABA含量的升高，可能是機體對腦缺血/再灌注損傷的一種保護反映。腦缺血時GABA腦內(nèi)釋放量升高，在腦缺血早期對Glu釋放增多引起的興奮性毒性有一定的保護作用，但GABA受體的缺血耐受性低于Glu受體，腦缺血到一定程度時，腦內(nèi)釋放的GABA并不能對抗腦缺血時Glu引起的神經(jīng)功能損害。

本研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血/再灌注可使海馬內(nèi)谷氨酸、GABA濃度的明顯升高而丹參酮B鈉鹽具有明顯對抗作用，腦缺血/再灌注海馬神經(jīng)元細胞外液谷氨酸含量，可能會影響谷氨酸能神經(jīng)元和GABA能神經(jīng)元分布的相應(yīng)改變，從而可能影響海馬內(nèi)興奮的傳遞。

[1]Xu XH,Zheng XX,Zhou Q,et al.Inhibition of excitatory amino acid efflux contributes to protective effects of puerarin against cerebral ischemia in rats[J].Biomed Environ Sci,2007,20(4):336-342.

[2]Zea Longa EL,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without cranectomy in rat[J].Stroke,1989,20(1):84-91.