蔡 青 ，張伯禮 ，黃淑蕓 ，汪 濤 ，譚俊珍 ，周 濤 ，李春深

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

谷氨酸（Glu）和 γ-氨基丁酸（GABA）是腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在突觸傳遞中起著重要的角色。已有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷可導(dǎo)致大鼠腦內(nèi)Glu/GABA比例失衡[1]。本研究通過建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，觀察丹參酮B鈉鹽對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠海馬內(nèi)Glu和GABA等神經(jīng)遞質(zhì)濃度的變化。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型制作

1.1.1 動物的分組及給藥方式 Wistar雄性大鼠體質(zhì)量280～350 g，天津中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，隨機(jī)分為5組，每組6只，分別為：偽手術(shù)組（Sham）、模型組（I/R）、丹參酮B鈉鹽（西安博勝生物科技有限公司）低劑量組（I/R+DT1，4 mg/kg）、中劑量組（I/R+DT2，8 mg/kg）、高劑量組（I/R+DT3，16 mg/kg）。各組于手術(shù)前3 d每天腹腔注射給藥1次，連續(xù)3 d，末次給藥30 min后，制備大鼠大腦中動脈閉塞再灌注模型（MCAO）后連續(xù)給藥兩次，其中偽手術(shù)組和模型組每天靜脈注射等體積生理鹽水。采用Zea-Long法[2]制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，假手術(shù)組除不進(jìn)線外,其余過程同缺血組。再灌注組在缺血2 h后輕輕抽出魚線,使之退出到頸總動脈剪口處即可。手術(shù)過程中大鼠體溫維持在（37±0.5）℃，再灌注24 h后取材。

1.2 溶液配制

1.2.1 衍生化試劑 稱取100 mg鄰苯二甲醛（OPA）置于2 mL甲醇中，充分溶解后加入β-巰基乙醇 60 μL，再加 0.4 mol/L 硼酸緩沖液（pH 9.5）至10 mL，避光 4℃冷藏備用。每次過夜加 20 μL，β-巰基乙醇，可用7 d。

1.2.2 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的配制 準(zhǔn)確稱量氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（美國Sigma公司），用50%的甲醇水定容至10 mL棕色瓶中作為貯備液。為1 g/L，4℃貯存。

1.2.3 梯度洗脫液的配制 A相：0.03 mol/L乙酸鈉溶液，B 相：甲醇/0.1 mol/L 乙酸鈉溶液（4∶1），0.45 μm微孔濾膜過濾，超聲脫氣備用。

1.3 取材、樣品制備 各組大鼠，用20%氨基甲酸乙酯（1～2 g/kg）腹腔麻醉后，快速斷頭，低溫條件下，剝離雙側(cè)海馬，收集于1.5 mL離心管內(nèi)并標(biāo)記，置-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。取海馬約50 mg，加200 μL無水乙醇在冰臺上磨成勻漿，吸出200 μL勻漿液，在15700 r/min、4 ℃條件下離心 20 min，取 80 μL 上清液測定氨基酸含量。

1.4 衍生化反應(yīng) 吸取40 μL氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液或腦組織上清液，加入20 μL衍生化試劑，反應(yīng)1 min后立即進(jìn)樣，進(jìn)樣量為25 μL。

1.5 色譜條件 色譜柱：大連依利特Hypersil ODS C18（4.6×200 mm，5 μm）；流動相：A 為 0.03 mol/L 的醋酸鈉緩沖液（pH＝7.2），B 相：甲醇/0.1mol/L 乙酸鈉溶液，梯度洗脫程序見表1。流速：1 mL/min，檢測波長：335 nm；柱溫：35℃。取25 μL進(jìn)樣分析，采用外標(biāo)法定量。將衍生好的樣品用微量進(jìn)樣器加入高效液相色譜儀（HP1100，Agilent，USA），并用高效液相色譜工作站LCsolution記錄數(shù)據(jù)。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 The gradient of mobile phase%

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線 將氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋為1～8號工作液，依次進(jìn)樣，用高效液相色譜儀檢測。在上述色譜條件下，兩種氨基酸得到有效分離，保留時(shí)間分別為：Glu（9.093 min），GABA（21.245 min），圖1為標(biāo)準(zhǔn)品1-4號工作液所得色譜圖，保留時(shí)間基本一致，重現(xiàn)性良好。兩種氨基酸在0.017～5 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)Glu為0.99987，GABA為r=0.9993，得出回歸方程如下：GLU：f=-39.8113+21132.7545x，GABA：f=-53.8116+8691.631 0x。

1.7 樣品測定 經(jīng)衍生化反應(yīng)的各組樣品按1.5色譜條件進(jìn)行檢測，用已知的各標(biāo)準(zhǔn)品氨基酸色譜峰保留時(shí)間與腦組織勻漿上清液的色譜峰保留時(shí)間對照定性，并精密度實(shí)驗(yàn)和回收率實(shí)驗(yàn)（結(jié)果未顯示）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 記錄到的數(shù)據(jù)，用HP1100高效液相色譜工作站LCsolution分析后，分別得到Glu和GABA的峰面積，將峰面積分別帶入回歸方程，可得到Glu和GABA的相對濃度。定量方法：用外標(biāo)法將三種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰面積值按以下公式進(jìn)行換算：C=R1/R2×D ×N，式中：R1=待測樣品的峰面積；R2=氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品峰面積；D=氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度（g/L）；N=稀釋倍數(shù)；C=待測樣品濃度（g/L），最終計(jì)算海馬組織中兩種氨基酸的含量。所得到的數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，顯著性水平為 P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮B鈉鹽腦缺血再灌注大鼠海馬谷氨酸含量的影響 圖2為典型的海馬組織勻漿高效液相圖片，各組谷氨酸含量如表所示（表2）。假手術(shù)組（Sham）谷氨酸含量顯著低于其他各組（P<0.01）。腦缺血對照組（I/R）谷氨酸含量顯著高于丹參酮B鈉鹽各組（P<0.01）。丹參酮B鈉鹽高劑量組（I/R+T3）谷氨酸含量顯著低于丹參酮B鈉鹽低劑量組（I/R+T1）、中劑量組（I/R+T2）（P<0.01）。

2.2 丹參酮B鈉鹽腦缺血再灌注大鼠海馬GABA含量的影響 圖2為典型的海馬組織勻漿高效液相圖片，各組GABA含量如表3所示。假手術(shù)組（Sham）GABA含量顯著低于腦缺血對照組（I/R）、丹參酮 B鈉鹽低劑量組（I/R+T1）和中劑量組（I/R+T2）（P<0.01）。丹參酮B鈉鹽高劑量組（I/R+T3）GABA含量顯著低于腦缺血對照組（I/R）、丹參酮B鈉鹽低劑量組（I/R+T1）和中劑量組（I/R+T2）（P<0.01）。丹參酮 B 鈉鹽低劑量組（I/R+T1）、中劑量組（I/R+T2）GABA含量低于腦缺血對照組（I/R），但無顯著差異。

表2 不同組大鼠海馬組織谷氨酸含量Tab.2 Glutamate content in rat hippocampus of different groups(n=6)mg/g

表3 不同組大鼠海馬組織GABA含量Tabl.3 GABA content in rat hippocampus of different groups mg/g

3 討論

近年來的研究表明，中樞高濃度的Glu水平會導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦缺血/再灌注可以導(dǎo)致海馬的Glu濃度上升，細(xì)胞外的Glu富集，可能通過改變突觸后NMDA受體的活性上調(diào)，引起大量Ca2+內(nèi)流引起急性的滲透性損傷和慢性的氧化損傷，而導(dǎo)致海馬神經(jīng)細(xì)胞的丟失，海馬的形態(tài)學(xué)損傷。因此，腦缺血/再灌注引起的海馬內(nèi)Glu濃度的升高，這可能造成海馬神經(jīng)細(xì)胞的興奮性毒性損傷，也可能是海馬損傷的基礎(chǔ)，是海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶能力下降的神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)基礎(chǔ)。

興奮性氨基酸與抑制性氨基酸的失衡，對激發(fā)興奮毒性起一定作用，是腦組織缺血后再灌注過程的主要分子機(jī)制之一。在腦組織中，GABA與Glu是一對重要的抑制與興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，兩者的平衡對維持腦功能至關(guān)重要。GABA含量的增加對興奮性和抑制性傳遞的平衡起著關(guān)鍵作用，可能通過突觸后膜超極化，減少鈣內(nèi)流，降低細(xì)胞代謝使突觸后神經(jīng)元處于保護(hù)性抑制狀態(tài)，并通過突觸前抑制減少興奮性氨基酸遞質(zhì)釋放，減少低灌注區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞死亡，進(jìn)而間接導(dǎo)致對缺血性腦損傷的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生特殊影響，從而對抗興奮性氨基酸的毒性作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，Glu/GABA比值的變化可在一定程度上反應(yīng)腦內(nèi)氨基酸遞質(zhì)的平衡情況，并影響到神經(jīng)生理功能的變化[9]。腦缺血/再灌注引起的谷氨酸含量的升高，同時(shí)導(dǎo)致的海馬GABA含量的升高，可能是機(jī)體對腦缺血/再灌注損傷的一種保護(hù)反映。腦缺血時(shí)GABA腦內(nèi)釋放量升高，在腦缺血早期對Glu釋放增多引起的興奮性毒性有一定的保護(hù)作用，但GABA受體的缺血耐受性低于Glu受體，腦缺血到一定程度時(shí)，腦內(nèi)釋放的GABA并不能對抗腦缺血時(shí)Glu引起的神經(jīng)功能損害。

本研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血/再灌注可使海馬內(nèi)谷氨酸、GABA濃度的明顯升高而丹參酮B鈉鹽具有明顯對抗作用，腦缺血/再灌注海馬神經(jīng)元細(xì)胞外液谷氨酸含量，可能會影響谷氨酸能神經(jīng)元和GABA能神經(jīng)元分布的相應(yīng)改變，從而可能影響海馬內(nèi)興奮的傳遞。

[1]Xu XH,Zheng XX,Zhou Q,et al.Inhibition of excitatory amino acid efflux contributes to protective effects of puerarin against cerebral ischemia in rats[J].Biomed Environ Sci,2007,20(4):336-342.

[2]Zea Longa EL,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without cranectomy in rat[J].Stroke,1989,20(1):84-91.