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        止喘湯對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥和氣道重塑的影響*

        2010-11-29 00:48:38張占鋒霍博雅
        天津中醫(yī)藥 2010年6期
        關(guān)鍵詞:重塑肺泡計(jì)數(shù)

        張占鋒,霍博雅

        (1.河南省鄢陵縣人民醫(yī)院內(nèi)科,鄢陵 461200;2.遼寧醫(yī)學(xué)院第三醫(yī)院中醫(yī)科,錦州 121001)

        哮喘是由多種細(xì)胞及細(xì)胞因子參與的慢性氣道炎癥性疾病,其發(fā)病率、病死率均呈逐年上升的趨勢(shì)。哮喘反復(fù)發(fā)作可引起氣道重塑,導(dǎo)致不可逆性氣流阻塞及持續(xù)性氣道高反應(yīng)性,只有控制或者逆轉(zhuǎn)了氣道重塑,哮喘才可能得到真正意義上的控制。中醫(yī)治療哮喘有著豐富的臨床經(jīng)驗(yàn),本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)致敏大鼠反復(fù)霧化吸入抗原建立慢性哮喘模型,觀察中藥復(fù)方早期干預(yù)對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥和重塑的影響。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備 8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠40只,體質(zhì)量(200±20)g(遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),隨機(jī)分成4組隨機(jī)分為4組:正常組、哮喘組、布地奈德(BUD)組和止喘湯組,每組10只。參照Holgate等[1]的方法復(fù)制大鼠慢性哮喘模型。第1、8天腹腔注射10%的卵蛋白(OVA)(GradeⅢOVA,SigmaA5378)混懸液1mL(內(nèi)含OVA 100 mg、氫氧化鋁100 mg)致敏,自15 d始分別將各組大鼠鼠置于30 cm×30 cm×40 cm有進(jìn)出兩口的有機(jī)玻璃箱內(nèi),以1%OVA溶液霧化吸入,0.5 mL/min,30 min/次,1次/d,共6周。止喘湯組:每次激發(fā)前30 min中藥灌胃(取生藥500 g,分別加8倍量的水,分別提取2次,每次1 h,過(guò)濾,常壓濃縮至500mL,由遼寧醫(yī)學(xué)院第三醫(yī)院中藥制劑室提供),按大鼠體質(zhì)量(10 mL/kg)給予。BUD組:激發(fā)前30 min生理鹽水灌胃及5 mL∶1 mg BUD(阿斯利康制藥有限公司,批號(hào)國(guó)藥準(zhǔn)字 H20030410,規(guī)格 5 mL∶20 mg)霧化吸入。哮喘組生理鹽水灌胃;正常組腹腔注射、灌胃及霧化吸入分別以生理鹽水代替。以大鼠呼吸急促、口唇發(fā)紺、點(diǎn)頭呼吸及站立不穩(wěn)等表現(xiàn)為模型建立成功的標(biāo)志。

        1.2 標(biāo)本采集 各組大鼠均于末次激發(fā)24 h內(nèi)取材。20%烏拉坦5 mL/kg腹腔麻醉,剪開(kāi)頸部皮膚,鈍性分離頸動(dòng)脈,取血2 mL置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中,采用常規(guī)計(jì)數(shù)法測(cè)定白細(xì)胞總數(shù)及其分類(lèi)。打開(kāi)胸腔,結(jié)扎右主支氣管,分離出頸部氣管,參考文獻(xiàn)[2]方法進(jìn)行左側(cè)支氣管肺泡灌洗,將收集的支氣管肺泡灌洗液(BAL)盛入15 mL塑料離心管(置于冰浴中),重復(fù)上述操作4次,收集全部 BAL(回收率>85%)計(jì)量后取少量在改良的Neubauer計(jì)數(shù)臺(tái)上計(jì)數(shù)BAL中白細(xì)胞總數(shù),余下的BAL 4℃離心(1500 r/min)10 min,取細(xì)胞沉淀涂片、瑞氏染色后在油鏡下作白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)。放血后取右肺中葉肺組織置于4%的多聚甲醛中抽氣固定48 h后,進(jìn)行脫水,透明,垂直于氣道取材,石蠟包埋,切片,片厚4 μm,切片按HE常規(guī)染色步驟染色。

        1.3 氣道炎癥和氣道壁厚度測(cè)定 蘇木精-伊紅(HE)染色后,每組隨機(jī)抽取10張切片,400倍光鏡下選擇內(nèi)徑100~200 μm的細(xì)支氣管區(qū),采集5處視野,計(jì)數(shù)單位氣道面積(2200 μm2)的炎性細(xì)胞數(shù),以評(píng)估氣道炎癥[3];每張切片選取3支內(nèi)周長(zhǎng)(支氣管基底膜周徑)為1000~3000 μm的膜性大、中級(jí)小支氣管,在100倍光鏡下參照文獻(xiàn)[4]用病理圖像分析系統(tǒng),測(cè)定支氣管基底膜周徑(Pbm)、總管壁面積(Wat)、平滑肌面積(Wam),并用Pbm將測(cè)量值標(biāo)準(zhǔn)化,分別以Wat/Pbm、Wam/Pbm表示,代表相應(yīng)管壁層的厚度。

        2 結(jié)果

        2.1 各組大鼠血、BAL中嗜酸性細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化情況 哮喘組與正常組比較外周血、BAL中嗜酸粒細(xì)胞(EOS)明顯升高(P<0.01);應(yīng)用藥物干預(yù)后,治療組與哮喘組相比較,上述指標(biāo)明顯下降(P<0.01);止喘湯與BUD組比較上述指標(biāo)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1-表2。

        表1 各組間外周血白細(xì)胞總數(shù)及分類(lèi)計(jì)數(shù)的比較(±s)Tab.1 Comparison of total and differential counts of Leukocyte in PB in different groups(±s)×109個(gè)/L

        表1 各組間外周血白細(xì)胞總數(shù)及分類(lèi)計(jì)數(shù)的比較(±s)Tab.1 Comparison of total and differential counts of Leukocyte in PB in different groups(±s)×109個(gè)/L

        注:與正常組比較▲P<0.01,與哮喘組比較★P<0.01,與BUD組比較▼P>0.05。

        組別正常組哮喘組BUD組止喘湯組n 10101010細(xì)胞總數(shù)9.9321±1.489240.1859±5.1696▲22.7128±3.3706★24.1346±1.9981★嗜酸粒細(xì)胞0.3839±0.09160.1565±0.0179▲0.0777±0.0209★0.0805±0.0155★淋巴細(xì)胞6.7447±0.989114.4961±1.8684▲9.6860±1.7925★10.0282±2.3649★

        表2 各組間BAL白細(xì)胞總數(shù)及分類(lèi)計(jì)數(shù)的比較Tab.2 Comparison of total and differential counts Leukocyte of BAL in different groups(±s)×109個(gè)/L

        表2 各組間BAL白細(xì)胞總數(shù)及分類(lèi)計(jì)數(shù)的比較Tab.2 Comparison of total and differential counts Leukocyte of BAL in different groups(±s)×109個(gè)/L

        注:與正常組比較▲P<0.01,與哮喘組比較★P<0.01,與BUD組比較▼P>0.05。

        組別正常組哮喘組BUD組止喘湯組n 10101010細(xì)胞總數(shù)3.6521±0.335910.5212±1.0067▲6.3331±0.7999★6.9139±0.4488★嗜酸粒細(xì)胞0.0133±0.00210.0379±0.0039▲0.0243±0.0025★0.0261±0.0028★淋巴細(xì)胞0.7481±0.06953.2847±0.3895▲1.8291±0.1799★1.9740±0.1604★

        2.2 病理形態(tài)學(xué)觀察 HE染色顯示,正常組支氣管、肺組織結(jié)構(gòu)正常,各級(jí)支氣管上皮完整,肺泡間隔正常,無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn);哮喘組支氣管黏膜上皮大片壞死和脫落,管壁以嗜酸粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,肺泡間隔、平滑肌和基底膜增厚;治療組支氣管黏膜上皮部分脫落,少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡間隔、平滑肌和基底膜較空白對(duì)照組略有增厚。見(jiàn)圖1。

        2.3 氣道炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)和形態(tài)學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果單位氣道面積內(nèi),哮喘組和治療組炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)高于正常組,哮喘組高于治療組(均P<0.01)。但治療組間炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)明顯差異(P>0.05)。形態(tài)學(xué)指標(biāo)顯示,哮喘組較對(duì)照組和治療組氣道壁厚度明顯增加(均 P<0.01),BUD 組與止喘湯組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3。

        表3 氣道炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)和形態(tài)學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果(±s)Tab.3 Counts of airway inflammatory cell and Morphological Indexes in different groups(±s)

        表3 氣道炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)和形態(tài)學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果(±s)Tab.3 Counts of airway inflammatory cell and Morphological Indexes in different groups(±s)

        注:與正常組比較▲P<0.01,與哮喘組比較★P<0.01,與BUD組比較◆P>0.05;各組間比較▼P>0.05。

        Pbm(Hm)組別Wat/Pbm正常組哮喘組BUD組止喘湯組炎性細(xì)胞(Wat)(個(gè)/2,200 μm2)11.65±1.2929.52±4.54▲16.81±3.37★18.43±2.00★◆1677.92±178.111663.93±292.021680.48±202.361728.67±239.5352.26±5.9477.92±9.47▲63.20±4.74★64.44±6.78★◆Wam/Pbm(μm2/μm)12.74±2.1429.96±4.50▲22.60±2.37★23.34±2.76★◆

        3 討論

        病理學(xué)研究表明,哮喘的病理改變涉及整個(gè)支氣管樹(shù),炎性細(xì)胞浸潤(rùn)不僅累及氣道壁,也出現(xiàn)于外周肺組織。Th2反應(yīng)介導(dǎo)的嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)已被認(rèn)為是哮喘氣道炎癥的一個(gè)顯著特征。氣道重塑是哮喘的重要病理特征之一,成為哮喘近年來(lái)研究的熱點(diǎn)之一,但其發(fā)生機(jī)制并未完全闡明?,F(xiàn)被普遍接受的提法是由于急性炎癥反復(fù)發(fā)作而轉(zhuǎn)變?yōu)槁匝装Y,氣道反復(fù)損傷與修復(fù),大量炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)浸潤(rùn)并繼發(fā)氣道重塑[5]。

        中醫(yī)認(rèn)為哮喘的病因是先天不足、臟腑失調(diào),宿痰內(nèi)伏、外邪觸發(fā),病久瘀血,以虛實(shí)夾雜、本虛標(biāo)實(shí)為特征。止喘湯(黨參、白術(shù)、茯苓、甘草、桑白皮、杏仁、葶藶子、黃芩、丹參、川芎)是基于哮喘基本病機(jī)證型的復(fù)方,由定喘湯合四君子湯加減而成。全方具有補(bǔ)益肺脾腎、活血化瘀、清泄肺熱、祛痰止咳平喘,為根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)研制的自擬中藥合劑,臨床應(yīng)用效果良好。現(xiàn)代藥理研究方中的甘草、杏仁、黃芩、丹參、川芎等都有不同的治療哮喘的作用。

        本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大鼠建立慢性哮喘模型,觀察中藥復(fù)方止喘湯對(duì)致敏大鼠抗原激發(fā)所產(chǎn)生的氣道炎癥及氣道重塑的影響。結(jié)果表明,致敏大鼠分別經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期反復(fù)抗原激發(fā),出現(xiàn)了支氣管壁及支氣管肺泡內(nèi)以嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎癥反應(yīng),氣道壁本身亦出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)性變化,表現(xiàn)為氣道壁的增厚、支氣管黏膜上皮脫落、上皮下纖維化、平滑肌細(xì)胞的增生肥大等,這些均為氣道重塑的特征性病理改變。筆者發(fā)現(xiàn)止喘湯不僅可以抑制氣道炎癥,降低外周血、BAL中EOS數(shù)量,而且能有效預(yù)防氣道重塑的發(fā)生。提示止喘湯可能通過(guò)減少EOS氣道浸潤(rùn)控制氣道炎癥,減輕和延緩氣道重塑;也可能通過(guò)其他途徑如炎性介質(zhì)或細(xì)胞因子等對(duì)氣道炎癥和重塑起作用[6];還可能本身就有抗氣道重塑的作用;明確機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為止喘湯作為哮喘臨床辨證治療的基礎(chǔ)方提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

        [1]Holgate ST,Peters-Golden M,Panettieri RA,et al.Roles of cysteinyl leukotrienes in airway inflammation,smooth muscle function,and remodeling[J].J Allergy Clin Immunol,2003,111(1):18-34.

        [2]史 菲,邱 晨.大鼠支氣管肺泡灌洗術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化操作的探討[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2002,12(4):67-69.

        [3]Henderson WR Jr,Tang LO,Chu SJ,et al.A role for cysteinyl leukotrienes in airway remodeling in a mouse asthma model[J].Am J Respir Crit Care Med,2002,165(1):108-116.

        [4]Pascual RM,Peters SP.Airway remodeling contributes to the progressive loss of lung function in asthma:an overview[J].J Allergy Clin Immunol,2005,116(3):477-486.

        [5]Cohn L,Elias JA,Chupp GL.Asthma:mechanisms of disease persistence and progression[J].Annu Rev Immunol,2004,22:789-815.

        [6]劉仁慧,郭 忻,趙宇昊.中藥復(fù)方抗支氣管哮喘模型氣道慢性炎癥的機(jī)制研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2007,34(10):1836-1837.

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