姚 振，朱桂才，任文雙，陳 漢

(長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

香根草種子外植體組織培養(yǎng)與快速繁殖

姚 振，朱桂才，任文雙，陳 漢

(長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

為建立香根草(Vetiveriazizanioides)種子的組織培養(yǎng)和快速繁殖體系，以香根草種子為外材料，進(jìn)行了種子萌發(fā)、叢生芽誘導(dǎo)、愈傷組織誘導(dǎo)與分化及生根研究。結(jié)果表明，種子在采收初期發(fā)芽率達(dá)到90%以上，4 ℃低溫貯藏能有限延長(zhǎng)種子的壽命；無(wú)菌苗叢生芽誘導(dǎo)系數(shù)高達(dá)7.3；在MS培養(yǎng)基上，0.5 mg/L的2,4-D對(duì)種子愈傷組織誘導(dǎo)效果最佳；愈傷組織在MS + 6-BA 2.0 mg/L + IAA 1.0 mg/L上分化率達(dá)到55.1%，繁殖系數(shù)為15.4；在添加0.2 mg/L IAA的MS培養(yǎng)基上，生根培養(yǎng)效果較好。

香根草(Vetiveriazizanioides)；種子；組織培養(yǎng)；快速繁殖

香根草(Vetiveriazizanioides)又名巖蘭草，是自然界具有最長(zhǎng)根系的多年生禾本科高大草本植物，具有生物量大、分蘗迅速、適應(yīng)性強(qiáng)、生態(tài)幅度寬、易栽種易管理等特點(diǎn)[1]。由于香根草在提取香根油、制造紙張、編織手工藝品、驅(qū)蟲(chóng)治病、保持水土、凈化污水、土壤改良、受損生態(tài)環(huán)境的修復(fù)以及用作飼料、燃料等方面的作用，受到各國(guó)政府、科學(xué)家和生產(chǎn)者的高度重視。香根草被全球100多個(gè)國(guó)家和地區(qū)引種栽種，用于水土流失治理與污染環(huán)境的改良，絕大多數(shù)都取得了良好效果，從而被稱(chēng)為“神奇牧草”[1～4]。

雖然香根草生態(tài)工程受到廣泛重視和應(yīng)用，然而種苗缺乏嚴(yán)重制約著進(jìn)一步推廣，而導(dǎo)致種苗缺乏的主要原因是繁殖速度過(guò)慢[5]。生產(chǎn)上通?？糠种昊蚍痔Y進(jìn)行繁殖，為了提高香根草的繁殖系數(shù)，國(guó)外已經(jīng)通過(guò)花序組織[6～8]、葉[8～10]及幼苗的其它部分[11]建立了再生體系，國(guó)內(nèi)也有相關(guān)報(bào)道[12，13]。

香根草分為開(kāi)花和不開(kāi)花2種，在印度北部發(fā)現(xiàn)的野生種大部分是有性繁殖，而印度南部2種習(xí)性都有發(fā)現(xiàn)[14]。2002年在廣東吳川野外采集到的香根草種子，成功繁殖出香根草幼苗，表明廣東吳川香根草屬于有性繁殖型，也反映了天然香根草之所以成群落分布的原因[15]。劉金祥等[16]利用種子繁殖香根草，并進(jìn)行了有性繁殖植株的生物學(xué)觀(guān)察。近期的研究表明，香根草在湖北的引種和種子繁殖是成功的[17]。

本研究在了解香根草種子發(fā)芽率、貯藏條件的基礎(chǔ)上，利用種子建立無(wú)菌體系，以無(wú)菌苗為材料進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)，以種子為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，進(jìn)一步研究激素配比對(duì)叢生芽、愈傷組織誘導(dǎo)與分化以及生根誘導(dǎo)的影響，建立以種子為材料的組織培養(yǎng)和快速繁殖體系，對(duì)于利用有性繁殖的變異，選育矮化、抗旱、耐寒和綠期較長(zhǎng)的新品種具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用香根草種植于長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院實(shí)踐教學(xué)基地，為2007年和2008年采收的種子。

1.2 方法

(1)貯藏溫度對(duì)種子壽命的影響 將2007年10至11月采收的種子，設(shè)置2種貯藏條件，即室溫保存和4 ℃低溫保存。貯藏的時(shí)間為10、12、14、17、18個(gè)月，貯藏后每次隨機(jī)抽取種子50粒，25 ℃恒溫培養(yǎng)2周后，記錄發(fā)芽的種子數(shù)目，計(jì)算發(fā)芽率。

(2)叢生芽的誘導(dǎo) 將種子用自來(lái)水沖洗數(shù)次，75%的酒精消毒30 s，然后轉(zhuǎn)入0.1%的升汞中浸泡8 min，最后用無(wú)菌水沖洗數(shù)次，晾干后轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基中25 ℃恒溫培養(yǎng)。

當(dāng)無(wú)菌苗長(zhǎng)出2～3片葉時(shí)，轉(zhuǎn)入從生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)。設(shè)計(jì)4個(gè)處理，2種誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS添加4.0 mg/L 6-BA為基本培養(yǎng)基，分別添加IAA和IBA，使用濃度為0.2 mg/L。每種叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的幼苗分別作剪葉和不剪葉處理。剪葉處理是將無(wú)菌苗上部的葉片剪掉一部分，然后將植株輕輕插入?yún)采空T導(dǎo)培養(yǎng)基中，剪葉處理的植株在幾天后會(huì)重新長(zhǎng)出新葉，繼續(xù)剪葉處理，持續(xù)直到有叢生芽的產(chǎn)生為止；不剪葉處理作對(duì)照。

每個(gè)處理3瓶，每瓶接種5顆，3次重復(fù)。從叢生芽出現(xiàn)開(kāi)始，每隔5～7 d記錄一次叢生芽數(shù)量，3個(gè)月后記錄總數(shù)，計(jì)算叢生芽誘導(dǎo)系數(shù)。叢生芽誘導(dǎo)系數(shù)=每瓶叢生芽總數(shù)/5。

(3)以香根草種子誘導(dǎo)愈傷組織 將種子置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)基設(shè)置2,4-D濃度4個(gè)水平(0、0.5、1.0、2.0 mg/L)，每處理種子50粒。分別在2周和4周以后記錄愈傷組織誘導(dǎo)率。愈傷組織誘導(dǎo)率(%)=(產(chǎn)生愈傷組織的種子數(shù)量/種子總數(shù))×100。

(4)繼代分化培養(yǎng) 將種子愈傷組織轉(zhuǎn)瓶于繼代分化培養(yǎng)基上，繼代分化培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基添加1.0 mg/L的NAA為基本培養(yǎng)基，設(shè)2種6-BA濃度(1.0、2.0 mg/L)，記錄愈傷組織分化率、繁殖系數(shù)。愈傷組織分化率(%)=(分化的愈傷組織數(shù)目/愈傷組織總數(shù))×100，繁殖系數(shù)=愈傷組織分化的芽總數(shù)/分化愈傷組織總數(shù)。

(5)生根誘導(dǎo)與移栽 分化的愈傷組織切成帶單個(gè)芽的小片和直接用無(wú)菌苗誘導(dǎo)的香根草叢生芽，剪掉葉片至1～2 cm長(zhǎng)度，2種材料轉(zhuǎn)瓶于3種生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。3種生根培養(yǎng)基分別為：MS + NAA 0.2 mg/L和MS + NAA 0.2 mg/L + IAA 0.2 mg/L，以MS培養(yǎng)基為對(duì)照。

直接用無(wú)菌苗誘導(dǎo)的叢生芽分為單株插入誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基中，采用MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，蔗糖30 g/L及瓊脂8 g/L，pH5.8。每個(gè)處理13棵植株，每瓶1棵。分化的愈傷組織帶單個(gè)芽切片插入誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基中，每處理15棵，每瓶1棵。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中記錄生根數(shù)、芽數(shù)，計(jì)算生根率。生根苗煉苗后，常規(guī)方法移栽。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子萌發(fā)率測(cè)定及貯藏條件

圖1 貯藏時(shí)間和貯藏溫度對(duì)香根草種子發(fā)芽率的影響Figure 1 Effects of storage time and temperature on seed germination rate of vetiver

室溫下保存的種子前3次發(fā)芽率分別為97%、84%、68%，最后2次沒(méi)有種子萌發(fā)。冷藏條件下的發(fā)芽率前3次與室溫下接近，分別為94%、89%、65%，后2次分別為45%、8%。從發(fā)芽率的結(jié)果看，初期90%以上的發(fā)芽率是遠(yuǎn)高于有關(guān)報(bào)道的。采收初期種子的發(fā)芽率很高，甚至全部萌發(fā)，但隨時(shí)間的推移發(fā)芽率慢慢下降(圖1)。室溫下貯藏種子的時(shí)間不能超過(guò)14個(gè)月，否則發(fā)芽率大幅下降。低溫貯藏對(duì)于延長(zhǎng)種子壽命是有利的，但延長(zhǎng)的時(shí)間也是有限的，低溫下貯藏不能超過(guò)17個(gè)月。

2.2 無(wú)菌苗的叢生芽誘導(dǎo)

種子接種于MS培養(yǎng)基上，7 d后種子開(kāi)始發(fā)芽，13 d后種子發(fā)芽率為96.7%。無(wú)菌苗轉(zhuǎn)入?yún)采空T導(dǎo)培養(yǎng)基后，約1個(gè)月產(chǎn)生大量叢生芽，3個(gè)月叢生芽誘導(dǎo)系數(shù)達(dá)到最高值。4個(gè)處理的叢生芽誘導(dǎo)系數(shù)差異不顯著(F=3.816，P=0.092)。從表1可以看出，2種激素組合都能夠誘導(dǎo)出叢生芽，培養(yǎng)基中添加6-BA + IAA的誘導(dǎo)效率要高于添加6-BA + IBA的處理，但差異不顯著(F=3.659，P=0.104)；剪葉處理的叢生芽誘導(dǎo)系數(shù)顯著高于不剪葉處理(F=8.414，P=0.027)。

表1 植株處理方式和培養(yǎng)基對(duì)香根草叢生芽誘導(dǎo)的影響Table 1 Effects of plant treatment and media on clustered shoots induction of vetiver

注：S-N-K法顯著性檢驗(yàn)，同列中不同字母表示在P=0.05水平上差異顯著。

表2 2,4-D濃度對(duì)香根草種子愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 2 Effects of different concentration of 2,4-D on seed callus induction of vetiver

2.3 愈傷組織誘導(dǎo)

接種5 d，對(duì)照組種子開(kāi)始露芽。在2,4-D誘導(dǎo)的情況下，種子前期出現(xiàn)大量帶芽的愈傷組織，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，芽逐漸消失。從最終誘導(dǎo)率看，0.5 mg/L 2,4-D濃度處理愈傷誘導(dǎo)率最高，達(dá)到了100%，較低濃度的2,4-D有利于誘導(dǎo)愈傷組織的形成(表2)。較高濃度2,4-D在早期可以抑制芽的生長(zhǎng)，但最終愈傷誘導(dǎo)率降低。

2.4 繼代分化培養(yǎng)

(1)6-BA對(duì)愈傷組織分化的影響 繼代4 d后2.0 mg/L濃度下的愈傷組織開(kāi)始分化，6 d后1.0 mg/L濃度下的愈傷組織開(kāi)始分化。1.0 mg/L濃度下平均分化率為27.4%，2.0 mg/L濃度下平均分化率為55.1%，從研究結(jié)果看，2.0 mg/L的6-BA有利于愈傷組織的分化，1.0 mg/L的6-BA有利于愈傷組織的繼代培養(yǎng)。

(2)繁殖系數(shù) 從表3可以看出，2.0 mg/L的6-BA能夠增加分化的繁殖系數(shù)。1.0 mg/L 6-BA及1.0 mg/L NAA激素誘導(dǎo)下，33個(gè)愈傷組織分化了9個(gè)，分化芽數(shù)121個(gè)，繁殖系數(shù)為13.6，2.0 mg/L BA及1.0 mg/L NAA激素誘導(dǎo)下，37個(gè)愈傷組織分化了20個(gè)，分化芽數(shù)309個(gè)，繁殖系數(shù)為15.4。不同的愈傷組織分化的芽數(shù)在4到30之間。

表3 不同6-BA濃度下愈傷組織分化的繁殖系數(shù)Table 3 Propagation coefficient of callus differentiation on different concentration of 6-BA

2.5 生根誘導(dǎo)

(1)采用無(wú)菌苗誘導(dǎo)的香根草叢生芽的生根誘導(dǎo) 無(wú)菌苗誘導(dǎo)的叢生芽分為單株插入誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基中，4周后，植株生根并產(chǎn)生分蘗。結(jié)果表明，從2個(gè)處理的無(wú)菌苗生根過(guò)程中產(chǎn)生的分蘗總數(shù)上看，添加NAA和IAA處理分蘗數(shù)的平均值為7.8，而單獨(dú)使用NAA的處理為3.9，表明同時(shí)添加NAA和IAA有利分蘗的誘導(dǎo)。

幾乎所有的植株都可以在生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生根，生根根數(shù)的平均數(shù)差異不大，同時(shí)添加NAA+IAA處理的為4.1，添加IAA處理的為3.6，根數(shù)從1到9，差異很大，個(gè)別不生根。試管苗在無(wú)激素的MS培養(yǎng)基上也能生根，但根系細(xì)弱、生長(zhǎng)緩慢。

表4 NAA與IAA對(duì)帶芽愈傷組織切片生根的影響Table 4 Effects of NAA and IAA on rooting of callus slices

(2)帶芽愈傷組織切片的生根誘導(dǎo) 20 d后，分化苗開(kāi)始生根，并發(fā)出很多小芽(表4)，帶單個(gè)芽的愈傷組織切片在2種培養(yǎng)基下產(chǎn)生的芽數(shù)相近，但培養(yǎng)基MS+0.2 mg/L IAA的生根率略高于培養(yǎng)基MS + 0.2 mg/L IAA + 0.2 mg/L NAA的。

3 小結(jié)與討論

3.1 香根草種子的萌發(fā)與壽命

香根草種子在剝離穎和稃前，有些是空粃，含有種子的顆粒本身帶有的病菌使得種子生活力下降，萌發(fā)時(shí)污染，這些可能是萌發(fā)低率的原因。前期的研究表明香根草種子的萌發(fā)率低于9.5%[17]，而本研究的發(fā)芽率在90%以上，可能是前期的研究中種子帶真菌和空秕的原因。香根草是一種典型的熱帶植物，但適應(yīng)性強(qiáng)，可在10～45 ℃的地區(qū)下生長(zhǎng)[18]，但本研究區(qū)域，由于冬季的低溫，結(jié)實(shí)穗比較少。熱帶植物的種子壽命一般比較短，低溫貯藏可以延長(zhǎng)種子的壽命。由于研究區(qū)域處于長(zhǎng)江流域，香根草的有效結(jié)實(shí)穗比較少，采收種子有限，研究受到種子數(shù)量的限制，沒(méi)能準(zhǔn)確得知種子發(fā)芽率下降的準(zhǔn)確時(shí)間，只是確定了種子發(fā)芽率下降大致的時(shí)間段?？偟恼f(shuō)來(lái)，香根草種子的壽命在2 a以?xún)?nèi)，限制了種子的長(zhǎng)期保存和利用。種子壽命詳細(xì)資料的獲得需要進(jìn)一步的研究。

3.2 剪葉處理可以促進(jìn)叢生芽誘導(dǎo)

禾本科植物的快速繁殖一般用在遺傳轉(zhuǎn)化、優(yōu)良植株的繁育等方面。利用無(wú)菌苗誘導(dǎo)叢生芽的方法比傳統(tǒng)的分蘗、插條、切頂?shù)确椒ê?jiǎn)便，并且不經(jīng)過(guò)愈傷組織階段直接誘導(dǎo)叢生芽可避免產(chǎn)生大量的變異，耗材少、不受季節(jié)限制、增殖效果顯著。本研究采用細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素結(jié)合，成功誘導(dǎo)了香根草的叢生芽，剪葉處理比不剪葉處理的叢生芽誘導(dǎo)率要高，可能是剪葉削弱了植株的頂端優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)了腋芽的發(fā)育。生長(zhǎng)素IBA和IAA也在叢生芽的誘導(dǎo)中起了作用，使用IAA的效果要好于IBA。香根草無(wú)菌苗植株比較高大，在MS培養(yǎng)基下產(chǎn)生叢生芽比較慢，這種剪葉處理在快速繁殖過(guò)程中，一方面可以節(jié)約空間，另一方面增加了繁殖的系數(shù)，具有重要的應(yīng)用意義。該項(xiàng)技術(shù)可能可以應(yīng)用在禾本科植物，如水稻、小麥的組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化中。

3.3 2,4-D在成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)中的作用

在誘導(dǎo)成熟胚愈傷組織過(guò)程中，2,4-D是用得最為廣泛的生長(zhǎng)素類(lèi)激素。水稻誘導(dǎo)愈傷組織，2,4-D是誘導(dǎo)愈傷組織的重要因素，在一定濃度范圍內(nèi)，2,4-D濃度越高，出愈率越高[19，20]。本研究采用2,4-D也成功誘導(dǎo)了香根草種子的愈傷組織。

3.4 生根誘導(dǎo)

來(lái)源于種子直接誘導(dǎo)的叢生芽的生根誘導(dǎo)與愈傷組織分化幼苗的生根誘導(dǎo)存在很大的區(qū)別，主要表現(xiàn)在生根過(guò)程中分蘗數(shù)的差異。愈傷組織分化幼苗的生根誘導(dǎo)中分蘗產(chǎn)生芽數(shù)多數(shù)在10以上，可能是研究中肉眼可見(jiàn)的帶單個(gè)芽的愈傷組織切片帶有很多芽體。在根的誘導(dǎo)中，NAA和IAA均對(duì)生根有促進(jìn)作用，在生產(chǎn)應(yīng)用中可以適當(dāng)添加這些激素促進(jìn)生根。

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2009-11-19

姚 振(1980-)，男，湖北荊州人，農(nóng)學(xué)碩士，講師，研究方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué)與植物學(xué).

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.02.017

Q813.1;Q949.71+4.2

A

1673-1409(2010)02-S053-05