鄒華文

李翠花，吳啟俠

(長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

一個玉米逆境響應(yīng)基因ZmSPK1表達(dá)載體的構(gòu)建及擬南芥轉(zhuǎn)化

李翠花，吳啟俠

(長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

首次在玉米(ZeamaysL.)中克隆了1個SnRK家族基因，命名為ZmSPK1。為了研究ZmSPK1的功能,把ZmSPK1的cDNA 連接到植物表達(dá)載體pGreen0029中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入擬南芥(Arabidopsis)中進(jìn)行過量表達(dá)。PCR及Western-blot分析表明，ZmSPK1已經(jīng)轉(zhuǎn)入到擬南芥中，并且在大多數(shù)轉(zhuǎn)化植株中穩(wěn)定表達(dá)。

玉米(ZeamaysL.)；SnRK；ZmSPK1；擬南芥(Arabidopsis)

植物中的SnRK1蛋白激酶家族在響應(yīng)逆境脅迫過程中起到了非常重要的作用。SNF1(sucrose non-fermenting-1)蛋白激酶家族包括酵母中的SNF1，哺乳動物的AMPK(AMP-activated protein kinase)以及高等植物中的SnRK，與CDPK親緣關(guān)系較近，同屬于CaMK組。在酵母中SNF1響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)低葡萄糖信號，并且對被葡萄糖抑制的基因的解除抑制作用是必須的，SNF1還可以直接調(diào)節(jié)許多代謝酶的磷酸化水平[1,2]。AMPK可以在高的AMP/ATP狀態(tài)下被AMP激活，同時也可以被它的上游蛋白激酶AMP-activated protein kinase kinase (AMPKK)所激活。有資料表明，活化的AMPK可以對哺乳動物細(xì)胞對不同逆境條件做出響應(yīng)[3～5]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，高等植物細(xì)胞中一些SnRKs序列與酵母和哺乳動物中的SNF1有很高的同源性暗示了它們在功能上的相似性[6]。植物中已經(jīng)鑒定了3個SnRK亞家族，分別是SnRK1，SnRK2和SnRK3。其中SnRK1與SNF1/AMPK家族具有直接的結(jié)構(gòu)和功能同源性[6]，與SnRK1相比，SnRK2和SnRK3與SNF1/AMPK在序列上的相似程度較低，是植物所特有的，并且可能參與植物對逆境的脅迫反應(yīng)。

SnRK2是一個相對較小的植物專一性基因家族，最近研究表明它們是受滲透脅迫激活的蛋白激酶。與SnRK1相比,SnRK2亞家族含有一個相對較短的C-端,C-端的一個顯著特征是其中含有一個短的酸性 “補(bǔ)丁” 。根據(jù)對被克隆成員的遺傳距離分析，表明SnRK2可以被分為2組：SnRK2a 和 SnRK2b。其中SnRK2a 組成員的酸性“補(bǔ)丁”中富含氨基酸Asp；而SnRK2 組成員的酸性“補(bǔ)丁”中富含氨基酸Glu[6]。

Kobayashi等[7]和Boudsocq等[8]分別對水稻和擬南芥基因組中的所有SnRK2成員進(jìn)行了系統(tǒng)的生化研究。Kobayashi等[7]發(fā)現(xiàn)水稻基因組中10個SnRK2成員可以對不同的逆境信號作出反應(yīng)，其中SAPK2、SAPK4、SAPK6和SAPK7都可以受NaCl的誘導(dǎo)表達(dá)。體外表達(dá)試驗發(fā)現(xiàn)，所有的10個成員都可以被滲透脅迫激活，但是僅有部分成員被ABA激活。表明不同的激酶成員有其獨(dú)特的滲透脅迫信號反應(yīng)方式。Boudsocq等[8]在對擬南芥基因組的10個SnRK2成員的研究中發(fā)現(xiàn)，其中9個SnRK2成員可以被甘露醇和NaCl所誘導(dǎo)激活，在這9個成員中又僅有5個可以同時被ABA激活；所有的SnRK2成員都不被冷處理激活。

筆者所在課題組通過同源克隆的方法，從玉米(ZeamaysL.)中克隆了1個全長的cDNA，編碼的蛋白與SnRK2b蛋白有很高的同源性。由于這個基因可以受不同的逆境條件誘導(dǎo)，所以把它命名為：ZmSPK1 (for stress-induced protein kinase)(accession number AY722708)。在酵母細(xì)胞中表達(dá)ZmSPK蛋白，激酶活性分析試驗發(fā)現(xiàn)，純化的ZmSPK1蛋白不但具有自我磷酸化功能，而且還可以催化底物磷酸化，說明ZmSPK1編碼一個有功能的蛋白激酶。半定量RT-PCR分析表明，ZmSPK1的表達(dá)可以被甘露醇、高鹽和脫落酸(abscisec acid,ABA)誘導(dǎo)；另外，在不同的組織中，ZmSPK1的表達(dá)水平也有很大的差異，在生殖器官中的表達(dá)量最高[9,10]。這些結(jié)果表明，ZmSPK1可能不但參與了植物對逆境的反應(yīng)過程，而且在植物的發(fā)育過程中起著重要的作用。為了研究ZmSPK1的生物學(xué)功能，本課題組構(gòu)建了植物表達(dá)載體，在擬南芥中過量表達(dá)ZmSPK1基因，希望從對轉(zhuǎn)基因植株的分析中初步了解其生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料為擬南芥(Columbia 生態(tài)型) ；菌株E.coliDH5α、農(nóng)桿菌GV3101均由農(nóng)業(yè)部作物營養(yǎng)與施肥重點實驗室保存。

DNA 凝膠回收試劑盒購自杭州V-gene 生物技術(shù)公司;DNA 限制性內(nèi)切酶、T4-DNA 連接酶、ExTaq 酶、DNAMarker DL2000+15000購自寶生物大連有限公司(Takara 產(chǎn)品)； anti-HA(3f10) 購自Roche Applied Science(Germany)； peroxidase-conjugated goat anti-rat IgG(H+L) 購自中杉金橋公司；PVDF 膜購自Milipore 公司；其他試劑都是國產(chǎn)分析純。PCR 引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成； DNA 測序工作由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2 試驗方法

(1)ZmSPK1基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建 在pBluescriptKS(+)中間載體上含有pBluescriptKS(+)-ZmSPK1-dHA-His6片段。用BamHⅠ/StuⅠ雙酶切上述載體質(zhì)粒，回收ZmSPK1的cDNA片斷，同時筆者所在實驗室的帶有外源基因的中間載體pUC18-cDNA-dHA也用相同的酶切，去除插入的外源基因，回收載體片斷，最后把兩個片斷連接，構(gòu)建成pUC18-ZmSPK1-dHA的中間載體。酶切驗證與預(yù)期結(jié)果一致后，用XbaⅠ/EcoRⅠ酶切，得到在35S啟動子、C4PPDK增強(qiáng)子控制下的片斷：35S -C4PPDK-ZmSPK1-dHA,同時，筆者所在實驗室保存的含有相同插入結(jié)構(gòu)(僅插入的外源基因不同)的植物表達(dá)載體pGreen0029,也用相同的雙酶切，回收載體片斷，與上述的插入片斷連接，得到在35S啟動子和增強(qiáng)子控制的，在pGreen0029載體里表達(dá)的ZmSPK1-dHA融合蛋白。連接體系4 ℃反應(yīng)24 h 后轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,轉(zhuǎn)化后挑取陽性克隆提質(zhì)粒酶切驗證,酶切驗證正確的菌液送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。以上所用所有載體均由本實驗室保存。

(2)ZmSPK1 基因的擬南芥轉(zhuǎn)化 正確連接的質(zhì)粒用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101,轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌用花浸蘸法[10]轉(zhuǎn)化擬南芥。

(3)轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR 分子檢測 轉(zhuǎn)化擬南芥T0 代的種子經(jīng)消毒后播在含卡那霉素( 濃度為50 μg/mL) 的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選,挑選在抗性培養(yǎng)基上正常生長的擬南芥植株提取基因組DNA,以DNA為模板,以ZmSPK片斷內(nèi)部的一對特異引物做PCR 鑒定。

(4)轉(zhuǎn)基因擬南芥的Western-blot 檢測 取0.3 g經(jīng)PCR 鑒定呈陽性的擬南芥幼嫩的葉片,加0.5 mL 蛋白提取緩沖液( 配方為：10 mmol/L Tris-HCl,0.02% NaN3,0.001% PMSF,pH8.0) ,液氮研磨后5 000 r/min、4 ℃離心10 min,吸取上清液,即為總蛋白提取液。取適當(dāng)總蛋白提取液電泳,轉(zhuǎn)膜后以小鼠單克隆抗體ant-HA 為一抗,peroxidase-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) 為二抗進(jìn)行Western-blot 檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmSPK1基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建

圖1 構(gòu)建好的ZmSPK1植物表達(dá)載體示意圖Figure 1 Restriction map of ZmSPK1 in plant expression vector pGreen0029

將含有ZmSPK1的片段插入pGreen0029載體相應(yīng)位置，構(gòu)建成如圖1所示的植物表達(dá)載體。連接體系轉(zhuǎn)化大腸桿菌后,挑陽性克隆提質(zhì)粒,進(jìn)行酶切驗證。結(jié)果如圖2 所示,所得的酶切片段與期望值完全一致,初步證明已經(jīng)連接成功。隨后，酶切驗證正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序,做進(jìn)一步驗證,測序結(jié)果確認(rèn)了重組質(zhì)粒的正確性( 測序圖未顯示)。

2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥的分子鑒定

經(jīng)過測序確認(rèn)的載體挑取酶切驗證正確的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101,在抗性培養(yǎng)基上挑取篩選后的GV3101單菌落，提質(zhì)粒首先進(jìn)行PCR驗證，選取兩管擴(kuò)增出陽性條帶的質(zhì)粒再一次轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提質(zhì)粒，酶切驗證正確的GV3101可以用來進(jìn)行下一步的擬南芥轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后收取T0代擬南芥種子,播在含有50 μg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基上。種子發(fā)芽后大多數(shù)幼苗子葉變黃,最后死亡,只有少部分幼苗仍然發(fā)綠,并且正常的長出真葉,保持正常的生長狀態(tài),這部分很有可能就是轉(zhuǎn)化了的幼苗(圖3)。

M:DNAmarker;1:重組質(zhì)粒pGreen0029-ZmSPK1-dHA經(jīng)Xba/PstⅠ雙酶切結(jié)果;2:重組質(zhì)粒pGreen0029-ZmSPK1-dHA經(jīng)SacⅠ單酶切結(jié)果圖2 重組質(zhì)粒pGreen0029-ZmSPK1-dHA的酶切驗證Figure2 RestrictionanalysisofrecombinantplasmidspGreen0029-ZmSPK1-dHAfragment圖3 擬南芥基因轉(zhuǎn)化T0代種子篩選Figure3 SelectionoftransgenicseedsfromT0generation

在抗性培養(yǎng)基上正常生長的T1代幼苗被轉(zhuǎn)移到土壤中，待植株充分長大，有足夠葉子時，取2～3片幼葉，提取總DNA，并以ZmSPK1基因的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果如圖4所示，野生型植株沒有擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，同時也發(fā)現(xiàn)，抗性篩選的幼苗也有假陽性，例如第6和第9泳道相對應(yīng)的株系就沒有陽性條帶。

經(jīng)PCR初步鑒定的株系，進(jìn)一步提取總蛋白，用anti-dHA單克隆抗體，通過Western-blot進(jìn)一步在蛋白水平檢測基因的表達(dá)。結(jié)果如圖5所示，多數(shù)PCR陽性株系在相應(yīng)的位置有特異性的印跡條帶，當(dāng)然有的株系和野生型植株一樣沒有印跡條帶，這個結(jié)果表明，有些轉(zhuǎn)基因株確實表達(dá)了目的基因，同時也有一些發(fā)生了基因沉默現(xiàn)象。

M:Marker;1:WT;2:質(zhì)粒陽性對照;3～11:不同的抗性株系圖4 T1代轉(zhuǎn)基因幼苗PCR鑒定Figure4 PCRanalysisofT1transgenicseedlings1:WT;2～6:不同的轉(zhuǎn)基因株系圖5 PCR鑒定呈陽性的植株的Western-blot鑒定Figure5 Western-blotanalysisofthedifferentlinesafterPCRanalysis

3 結(jié)論與討論

有研究結(jié)果顯示，SnRK2b組的許多成員參與了高鹽或者高滲透脅迫反應(yīng)。例如PK-3和SPK-4都可以被脫水和高鹽所誘導(dǎo)表達(dá)[11]；水稻基因組中10個SnRK2成員都可以對不同的逆境信號作出反應(yīng)，其中SAPK2、SAPK4、SAPK6和SAPK7可以受NaCl的誘導(dǎo)表達(dá)[7]，通過在NCBI中比對，可以發(fā)現(xiàn)ZmSPK1與SAPK6氨基酸序列的一致性最高，達(dá)到了90%；擬南芥基因組中10個SnRK2成員中的9個成員可以被甘露醇和NaCl所誘導(dǎo)激活[8]，ZmSPK1與其中的SnRK2.4氨基酸序列一致性達(dá)到78%，并且ZmSPK1序列也是通過SnRK2.4基因序列作為探針獲得的；另外，本研究中RT-PCR實驗也表明ZmSPK1的表達(dá)受高鹽和滲透脅迫的誘導(dǎo)。因此推斷本課題組克隆的ZmSPK1參與了植物的抗鹽信號途徑。為了驗證并探明其在抗鹽途徑中的作用，本研究構(gòu)建了ZmSPK1的植物表達(dá)載體，成功轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥中，并且獲得了穩(wěn)定表達(dá)的株系，后期的功能驗證工作正在進(jìn)行中。

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2010-03-03

國家自然科學(xué)基金項目(30700433)；中國農(nóng)科院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，農(nóng)業(yè)部作物營養(yǎng)與施肥重點實驗室開放基金(KFJJ2010-03)

鄒華文(1973-)，男，江蘇邳州人，理學(xué)博士，副教授，研究方向為植物逆境分子生物學(xué).

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.02.016

S513;Q789

A

1673-1409(2010)02-S049-04