劉 峰

趙伊英

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子 832003)

鄭金貴

(農(nóng)業(yè)部海峽兩岸農(nóng)業(yè)技術(shù)合作中心，福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

秈稻胚乳特異性啟動(dòng)子Gt1的克隆及其功能驗(yàn)證

趙伊英

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子 832003)

鄭金貴

(農(nóng)業(yè)部海峽兩岸農(nóng)業(yè)技術(shù)合作中心，福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

從秈稻(OryzasativaL.ssp.indica)品種谷稈兩用稻‘東南201’中克隆獲得胚乳特異性啟動(dòng)子Gt1；序列全長(zhǎng)為929 bp；含胚乳中特異表達(dá)所必需的正調(diào)控元件GCN4 motif(TGAGTCA)與Skn-1 motif(GTCAT)等。與已報(bào)道的粳稻品種‘日本晴’的序列相比，秈稻‘東南201’Gt1啟動(dòng)子序列僅在-507 bp處發(fā)生一個(gè)堿基突變，在-268、-267、-194、-193 bp位置處分別缺失1個(gè)堿基；但在已知功能motif，兩者沒(méi)有任何差異。用Gt1替代35SCaMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因轉(zhuǎn)化水稻‘臺(tái)粳9號(hào)’，結(jié)果表明GUS基因僅在胚乳中特異表達(dá)，而在其它組織中未表達(dá)?？寺〉亩i稻谷蛋白基因Gt1的啟動(dòng)子序列，可為進(jìn)一步開(kāi)展水稻品質(zhì)分子改良提供必要手段。

胚乳特異性啟動(dòng)子；秈稻(OryzasativaL.ssp.indica)；轉(zhuǎn)基因

啟動(dòng)子是基因表達(dá)所必需的，其決定了外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的空間、時(shí)間和表達(dá)的強(qiáng)度等，是人們定向改造生物的重要限制因素[1]。目前在植物表達(dá)載體中廣泛應(yīng)用的啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。然而，由于組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因在受體植物內(nèi)所有部位持續(xù)的表達(dá)，不僅造成浪費(fèi)，而且往往會(huì)影響植株正常的生長(zhǎng)發(fā)育[2]。組織特異型啟動(dòng)子可將外源基因集中在某一時(shí)間和/或目標(biāo)組織中表達(dá)，不僅可避免因在轉(zhuǎn)基因植株非目標(biāo)組織中表達(dá)所造成的能量浪費(fèi)，而且也可避免因在非收獲器官或組織中表達(dá)目標(biāo)蛋白而造成的轉(zhuǎn)基因食品的潛在不安全性等[3～7]。因此，組織特異性啟動(dòng)子不僅有助于闡明植物形態(tài)、發(fā)育、代謝途徑等基礎(chǔ)理論，而且具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。胚乳特異型啟動(dòng)子是組織特異型啟動(dòng)子的一種，它可以控制外源基因在植物胚乳中高效表達(dá)，避免外源基因在植物的其他部位表達(dá)，從而減少對(duì)植物的不利影響。水稻種子(胚乳)中的蛋白主要由醇溶蛋白和谷蛋白組成；其中谷蛋白占種子貯存蛋白的70%～80%[8]。因此，以水稻為材料，從水稻谷蛋白基因Gt1的上游序列克隆出胚乳特異性啟動(dòng)子，對(duì)利用胚乳特異性啟動(dòng)子控制外源基因在水稻胚乳中特異表達(dá)具有重要理論和實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

秈稻(OryzasativaL.ssp.indica)品種‘東南201’為克隆啟動(dòng)子的實(shí)驗(yàn)材料，是農(nóng)業(yè)部海峽兩岸農(nóng)業(yè)技術(shù)合作中心選育的優(yōu)質(zhì)特種谷稈兩用稻。粳稻(OryzasativaL.ssp.japonica)品種‘臺(tái)粳9號(hào)’為水稻轉(zhuǎn)化材料。

1.2 菌種、質(zhì)粒與主要試劑

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105；質(zhì)粒載體pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存提供；克隆載體pMD18-T、ExTaq酶、各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶等購(gòu)自大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司。

1.3 秈稻‘東南201’基因組DNA的提取及PCR法獲得目標(biāo)片段

采用百泰克生物工程公司植物基因組DNA提取試劑盒，提取‘東南201’的基因組DNA；以Takaiwa等[9]報(bào)道的粳稻品種‘日本晴’的Gt1序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性引物(劃線部位為增加的HindIII與BamH Ⅰ酶切位點(diǎn))：

G-P1:5’-GCGAAGCTTAGGTCATAGGGAGAGGGAGCT-3’

HindⅢ

G-P2:5’-GGCGGATCCGTTGTTGTAGGACTAATGAACTGAATG-3’

BamHⅠ

以獲得的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)；擴(kuò)增條件為94 ℃ 5 min，35個(gè)循環(huán)(94 ℃ 1 min，56 ℃ 5 min，72 ℃ 1 min)，72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物膠回收操作步驟參照百泰克生物公司多功能DNA純化回收試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行。參照TaKaRa公司pMD18-T Vector試劑盒的說(shuō)明將目的片段連接到pMD18-T Vector上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選抗Amp菌落，同時(shí)進(jìn)行菌落PCR鑒定和測(cè)序；并命名為pMD-Gt1。

1.4 載體構(gòu)建和水稻遺傳轉(zhuǎn)化

利用DNA重組實(shí)驗(yàn)技術(shù)[10]構(gòu)建質(zhì)粒載體。用HindⅢ與BamHⅠ雙酶切質(zhì)粒載體pMD-Gt1，回收小片段(Gt1序列)；同樣，用HindⅢ、BamHⅠ雙酶切質(zhì)粒載體pBI121，回收大片段。再將回收的小片段和大片段進(jìn)行定向連接獲得含Gt1序列與GUS基因的表達(dá)載體pBI121-Gt1。再用HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切質(zhì)粒載體pBI121-Gt1，回收小片段；與此同時(shí)，HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切質(zhì)粒載體pCAMBIA1300，回收大片段。再將此次回收的小片段和大片段進(jìn)行定向連接獲得含Gt1序列與GUS基因的水稻表達(dá)載體p1300-Gt1-GUS。采用凍融法將質(zhì)粒p1300-Gt1-GUS導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中。與此同時(shí)，表達(dá)載體pCAMBIA1301也直接被導(dǎo)入另外的根癌農(nóng)桿菌EHA105中，用來(lái)作為對(duì)比研究。限制性內(nèi)切酶酶切及連接反應(yīng)的反應(yīng)體系、反應(yīng)時(shí)間等均參照TaKaRa公司產(chǎn)品使用說(shuō)明進(jìn)行。

水稻遺傳轉(zhuǎn)化基本培養(yǎng)基為NB培養(yǎng)基[11]；取授粉后10～15 d左右的未成熟‘臺(tái)粳9號(hào)’種子去殼后，于超凈工作臺(tái)，經(jīng)70%的乙醇表面消毒1 min后，再用2% NaClO消毒28 min，無(wú)菌水漂洗4～5次，用解剖針挑出幼胚并接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，Parafilm封嚴(yán)，26 ℃，暗培養(yǎng)。每16～18 d繼代1次，繼代3～6次的胚性愈傷組織用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。愈傷組織轉(zhuǎn)化、篩選、抗性愈傷分化及生根參照本課題組前期的研究[12]。

1.5 轉(zhuǎn)基因水稻的PCR檢測(cè)

使用百泰克生物工程公司植物基因組DNA提取試劑盒，提取轉(zhuǎn)化的‘臺(tái)粳9號(hào)’植株的基因組DNA；設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)：GUS-F:5’-GCAACTGGACAAGGCACT-3’；GUS-R:5’-GCGTCGCAGAACATTACA-3’，其擴(kuò)增GUS基因部分序列(680 bp)；進(jìn)行PCR 檢測(cè)。

1.6 GUS檢測(cè)方法

采用組織化學(xué)染色法檢測(cè)GUS在水稻組織細(xì)胞中的表達(dá)。取轉(zhuǎn)化水稻植株不同部位的材料至小離心管中，加入適量GUS染色液(50 mmol/L PBS,pH 7.0；0.5 mol/L X-Gluc；50 mmol/L potassium ferricyanide；50 mmol/L potassium ferrocyanide；10 mmol/L EDTA、0.001% Triton X-100以及20%甲醇)。于37 ℃保溫1 h至過(guò)夜；然后轉(zhuǎn)入70%乙醇中脫色后觀察。

1～3：水稻植株的PCR特異性擴(kuò)增；4：DL 2000 Marker圖1 PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)秈稻‘東南201’胚乳特異性啟動(dòng)子序列Figure 1 Specific PCR amplification for Gt1 promoter sequence of “DN201”,an indica variety

2 結(jié)果與分析

2.1 胚乳特異性啟動(dòng)子的克隆與序列分析

應(yīng)用植物基因組提取試劑盒提取秈稻品種‘東南201’葉片基因組DNA，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳顯示約在1 000 bp左右出現(xiàn)特異性條帶(圖1)。采用T-A克隆方法將PCR產(chǎn)物與pMD18-T連接、轉(zhuǎn)化，獲得重組質(zhì)粒，命名為pMD-Gt；陽(yáng)性克隆測(cè)序表明，片段全長(zhǎng)為929 bp(圖2)，其中包括35個(gè)核苷酸的5’UTR序列。對(duì)序列 motifs分析表明，克隆到的秈稻Gt1啟動(dòng)子核苷酸序列中含有在胚乳中特異表達(dá)所必需的正調(diào)控元件GCN4 motif(TGAGTCA)，Skn-1 motif(GTCAT)，序列上游-31 bp處包含一個(gè)TATA box(TATAAA)、-231 bp處包含一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS：AGGAGG)；此外該序列還包含2個(gè)TAAATG motif(TAAATG)、1個(gè)CAC motif(CACCC)。該序列中不含有CAAT box(CCAAT)，這也與Takaiwa等[9]報(bào)道的粳稻品種‘日本晴(Nipponbare)’的研究一致。

與Takaiwa等[9]在粳稻品種‘日本晴’的研究的序列相比，兩者的一致性達(dá)99%；克隆的秈稻品種‘東南201’啟動(dòng)子的片段僅在-507 bp處發(fā)生一個(gè)堿基突變；在-268 bp、-267 bp、-194 bp、-193 bp位置處分別缺失1個(gè)堿基。但在已知功能區(qū)(motifs)秈稻‘東南201’與粳稻‘日本晴’沒(méi)有差異。從秈稻品種‘東南201’中克隆獲得的胚乳特異性啟動(dòng)子Gt1的全長(zhǎng)序列已在GenBank 登錄，登錄號(hào)為EU441217。

Skn-1 motif:胚乳中特異表達(dá)所必需的正調(diào)控元件:GCN4 motif:胚乳特異性表達(dá)的順式調(diào)控元件；下劃線或粗體標(biāo)出的分別為T(mén)ATA 盒(TATAAA)，RBS(AGGAGG)，基序TAAATG(TAAATG)與CAC(CACCC)等；克隆獲得的胚乳特異性啟動(dòng)子Gt1的全長(zhǎng)序列已在GenBank 登錄，登錄號(hào)為EU441217。圖 2 克隆的秈稻‘東南201’(DN201)Gt1與粳稻‘日本晴’(RBQ)的Gt1序列比較Figure 2 Sequence comparison of Gt1 promoter from indica-type rice “DN201” and Gt1 promoter from japonica-type “Nipponbare”

2.2 轉(zhuǎn)化植株的分子檢測(cè)

使用分別含有p1300-Gt1-GUS及pCAMBIA1301表達(dá)載體(圖3)的農(nóng)桿菌EHA105分別轉(zhuǎn)化水稻胚性愈傷，都獲得轉(zhuǎn)化植株。對(duì)轉(zhuǎn)化植株GUS基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，從轉(zhuǎn)化植株擴(kuò)增獲得預(yù)期的680 bp的目的基因片段，而未轉(zhuǎn)化的原品種未擴(kuò)增出任何片段(圖4)。

35Spro:35S啟動(dòng)因子;HPT:潮霉素選擇標(biāo)記基因;TpolyA:tpolyA終止子:RB:左邊界;LB:左邊界;Gt1:從燦稻品種“東南201”中克隆獲得的胚乳特異性啟動(dòng)子圖3 水稻高效表達(dá)載體pCAMBIA1301與p1300-Gt1-GUS的T-DNA區(qū)Figure3 SchematicrepresentationofpCAMBIA1301andp1300-Gt1-GUSexpressioncassettesusedforricetransformation1:DL2000Marker;2～3:pCABIA1301轉(zhuǎn)化獲得的植株;4～6:P1300-Gt1-GuS轉(zhuǎn)化獲得的植株;7:非轉(zhuǎn)化對(duì)照植株;8:質(zhì)粒p1300-Gt1-GuS圖4 水稻植株葉片PCR檢測(cè)GUS基因Figure4 DetectionofGUSgeneincontrol-andtransgenicriceleavesbyPCR

2.3 轉(zhuǎn)GUS基因的水稻植株的GUS檢測(cè)

為了確證所克隆的啟動(dòng)子的功能，取轉(zhuǎn)基因植株不同部位的組織進(jìn)行GUS檢測(cè)。對(duì)水稻植株的根、莖、葉片、種子等組織的GUS檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)p1300-Gt1-GUS表達(dá)載體的植株的GUS基因只在胚乳中特異性表達(dá)(圖5)，其它組織染色均為陰性；而轉(zhuǎn)pCAMBIA1301表達(dá)載體的植株在35SCaMV啟動(dòng)子作用下，GUS染色均為陽(yáng)性。由此可以確認(rèn)，Gt1為胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子。

1:非轉(zhuǎn)基因原水稻品種；2:轉(zhuǎn)pCAMBIA1301水稻植株；3:轉(zhuǎn)p1300-Gt1-GUS水稻植株圖5 胚乳特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因在‘臺(tái)粳9號(hào)’胚乳中特異性表達(dá)Figure 5 The endosperm-specific expression of GUS gene driven by Gt1 promoter in rice ‘Taijing No.9’

3 討論

近年來(lái)，利用胚乳特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)，進(jìn)而改良水稻品質(zhì)的研究越來(lái)越得到人們的重視。轉(zhuǎn)基因育種研究中，利用具有特異性表達(dá)特性的啟動(dòng)子被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因高表達(dá)的重要途徑，也是培育高效、安全轉(zhuǎn)基因作物的首選[4]。Gt1啟動(dòng)子能有效啟動(dòng)目標(biāo)基因在水稻胚乳中表達(dá)，以其作為啟動(dòng)子已先后獲得了能降低血清膽固醇作用的“大豆米”(Soy-rice)[13]、可預(yù)防貧血的“鐵蛋白米”(Ferritin rice)[14]和“高鐵米”(Iron-rich rice)[15]等。

本研究克隆獲得的秈稻‘東南201’谷蛋白基因的5’端啟動(dòng)子序列，與Takaiwa等[9]報(bào)道的序列共有5個(gè)堿基的差異。Takaiwa等[9]獲得的序列是對(duì)日本粳稻品種‘日本晴(Nipponbare)’基因組DNA分析的結(jié)果，而本研究用的是秈稻品種‘東南201’。不同類(lèi)型或品種間在同一個(gè)基因的啟動(dòng)子序列有可能存在一定的差異。然而對(duì)序列motifs分析表明，就重要功能區(qū)域來(lái)說(shuō)，秈稻‘東南201’與粳稻‘日本晴’沒(méi)有差異，兩者具有相同的在胚乳中特異表達(dá)所必需的正調(diào)控元件、motifs等；這也說(shuō)明生物體在進(jìn)化過(guò)程中功能區(qū)域的高度保守性，不會(huì)因?yàn)榄h(huán)境等因素的變化而改變其遺傳性。

轉(zhuǎn)化植株經(jīng)PCR鑒定GUS基因存在的情況下，用X-Gluc檢測(cè)液對(duì)GUS基因表達(dá)的情況進(jìn)行鑒定，從而驗(yàn)證了該啟動(dòng)子的功能。轉(zhuǎn)基因表達(dá)要求具有經(jīng)濟(jì)有效的高水平的重組蛋白表達(dá)體系；植物種類(lèi)繁多，遺傳多樣性豐富，植物基因的啟動(dòng)子和調(diào)控序列類(lèi)型也多種多樣，利用能在宿主體內(nèi)高效表達(dá)的特異性啟動(dòng)子是提高外源基因在植物體內(nèi)表達(dá)的一個(gè)有效途徑。本研究克隆了秈稻谷蛋白基因Gt1的啟動(dòng)子序列，并證明其能引導(dǎo)GUS基因在胚乳進(jìn)行組織特異性表達(dá)；這為我們進(jìn)一步開(kāi)展水稻品質(zhì)分子改良提供重要手段。

[1]董志峰，馬榮才，彭于發(fā)，等.轉(zhuǎn)基因植物中外源非目的基因片段的生物安全研究進(jìn)展[J].植物學(xué)報(bào)，2001,43(7):661～672.

[2]王 穎，麥維軍，梁承鄴，等.高等植物啟動(dòng)子的研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報(bào)，2003，23(11):2040～2048.

[3]劉巧泉，于恒秀，張文娟，等.水稻rbcS啟動(dòng)子控制的外源基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的特異性表達(dá)[J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào),2005,31 (3):247～253.

[4]Zuo J R,Chua N H.Chemical-inducible systems for regulated expression of plant genes[J].Curr Opin Biotech,2000,11:146～151.

[5]Morris S H,Adley C C.Irish public perceptions and attitudes to modern biotechnology:an overview with a focus on GM foods[J].Trends Biotechnol,2001,19(2):43～48.

[6]Hails R,Kinderlerer J.The GM public debate:context and communication strategies[J].Nat Rev Genet,2003,4:819～825.

[7]Kuiper H A,Kleter G A,Noteborn H P,etal.Assessment of the food safety issues related to genetically modified foods[J].Plant J,2001,27(6):503～528.

[8]張憲銀，薛慶中.水稻胚乳特異性啟動(dòng)子Gt1的克隆及其功能驗(yàn)證[J].作物學(xué)報(bào)，2002,28(1):110～114.

[9]Takaiwa F,Ebinuma H,Kikuchi S,etal.nucleotide sequence of a rice glutelin gene[J].FEBS letters,1987,220:43～47.

[10]J 薩姆布魯克,E F費(fèi)里奇,T 曼尼阿蒂斯(金冬雁,黎孟楓譯).分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第2版)[M].北京:科學(xué)出版社,1995.

[11]Chen L,Zhang S,Beachy RN,etal.A protocol for consistent,large scale production of fertile transgenic rice plants[J].Plant Cell Rep,1998,18:25～31.

[12]Liu F,Zhao Y Y,Su Y C,etal.Production of Marker-free transgenic rice with PEPC gene byAgrobacterium-mediated co-transformation[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2005,11:393～398.

[13]Katsube T,Kurisaka N,Ogawa M,etal.Accumulation of soybean glycinin and its assembly with the glutelins in rice[J].Plant Physiol,1999,120:1063～1073.

[14]Goto F,Yoshihare T,Shigemoto N,etal.,Iron fortification of rice seed by the soybean ferritin gene[J].Nat Bitechnol,1999,17 (3):282～286.

[15]Lucca P R,Hurrell R,Potrykus I.Genetic engineering approaches to improve the bioavailability and the level of iron in rice grains[J].Theor Appl Genet,2001,102:392～397.

2009-05-27

國(guó)家自然科學(xué)基金(30671276)；國(guó)家轉(zhuǎn)基因重大專(zhuān)項(xiàng)(2009ZX08001-032B)；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2009J01058)

劉 峰(1976-)，男，河南固始人，理學(xué)博士，副研究員，主要從事品質(zhì)生物技術(shù)研究.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.02.015

S188

A

1673-1409(2010)02-S044-05