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        選擇性聚乙二醇化賴氨酸的合成*

        2010-11-26 01:55:28汪林發(fā)李同金周祖文田茂奎楊大成
        合成化學 2010年6期
        關(guān)鍵詞:羰基賴氨酸聚乙二醇

        汪林發(fā), 李同金, 周祖文, 田茂奎, 楊大成

        (西南大學 化學化工學院,重慶 400715)

        聚乙二醇(PEG)技術(shù)是將PEG與治療性的藥物(蛋白質(zhì)、多肽或小分子化合物)連接以改變被修飾藥物的特性。上市的PEG修飾藥物與未修飾分子相比,具有半衰期增長、溶解性增加、穩(wěn)定性增強、酶降解作用減少、免疫原性及抗原性減弱、毒性及用藥頻率降低等突出優(yōu)點[1~5]。

        賴氨酸及其衍生物是合成多肽類藥物的重要中間體,近年來在生物學、藥學、醫(yī)學等方面應用廣泛[6~8]。本文擬通過PEG技術(shù)將PEG與適宜的賴氨酸聯(lián)接,制備一些新型的賴氨酸衍生物,期望可以方便地用于某些蛋白質(zhì)、多肽藥物的合成及修飾,獲得更安全、療效更顯著的藥物分子。

        本文選用Fmoc-Lys(Boc)-OH(1)為起始原料,經(jīng)過羧基芐酯化、側(cè)鏈Boc脫除和ε-氨基丁二酸酐修飾得到功能化的賴氨酸化合物N-α-芴甲氧羰基-N-ε-(γ-氧代丁酸)-L-賴氨酸芐酯(4);1和4再分別與單甲氧基聚乙二醇(mPEG-6000,簡稱mPEG)在偶聯(lián)劑的作用下聯(lián)接,最終分別實現(xiàn)了賴氨酸主鏈和側(cè)鏈的mPEG定點修飾,合成了新型的N-α-芴甲氧羰基-N-ε-(γ-氧代丁酸聚乙二醇酯)-L-賴氨酸芐酯(5,總收率52.6%, Scheme 1)和N-ε-叔丁氧羰基-N-α-芴甲氧羰基-L-賴氨酸聚乙二醇酯(6,收率93.7%, Scheme 1),其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR, IR和MS表征。各步反應收率在78.5%~93.4%,后處理較為簡便。5和6已經(jīng)成功應用在后續(xù)的多肽PEG修飾[9,10]研究中。

        Scheme1

        1 實驗部分

        1.1 儀器與試劑

        北京福凱儀器有限公司X-6型精密顯微熔點儀;美國AV-300型核磁共振儀(CDCl3/DMSO-d6為溶劑,TMS為內(nèi)標);美國GX型FT-IR紅外光譜儀(KBr壓片); 美國Agilent 1946B ESI-MS型質(zhì)譜儀。

        1和1-羥基苯并三氮唑(HOBt),分析純,成都凱泰新技術(shù)有限責任公司;溴化芐,分析純,上海試劑三廠;丁二酸酐,化學純,中國醫(yī)藥集團上?;瘜W試劑公司;N,N′-二異丙基碳二亞胺(DIC),分析純,山東淄博暢順工貿(mào)有限公司;二異丙基乙二胺(DIPEA),化學純,浙江新德化工有限公司;mPEG,分析純,北京百靈威;4-二甲氨基吡啶(DMAP),分析純,愛斯特醫(yī)藥技術(shù)有限公司;其余所用試劑均為市售分析純。

        1.2 合成

        (1)N-α-芴甲氧羰基-N-ε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸芐酯(2)的合成

        在圓底燒瓶中依次加入1 5.154 g(11 mmol), EtOAc 15 mL及Et3N 1.5 mL(11 mmol),攪拌使其溶解;緩慢滴加溴化芐2.2 mL(12 mmol),滴畢,回流反應5 h;室溫攪拌約11 h。抽濾,濾液依次用0.5 mol·L-1NaHCO3溶液(2×10 mL),飽和NaCl溶液(3×10 mL)洗滌,無水Na2SO4干燥,減壓蒸餾得粗品6.278 g。經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑:A=V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)=2 ∶1]純化得白色固體2 5.740 g,收率93.4%, m.p.78.5 ℃~79.4 ℃;1H NMRδ: 1.29~1.32(m, 2H, c-H), 1.43(s, 9H, CH3), 1.51~1.64(m, 2H, d-H), 1.67~1.95(m, 2H, b-H), 3.04~3.09(m, 2H, d-H), 4.13(t,J=6.1 Hz, 1H, a-H), 4.24~4.47(m, 3H, CO2CH2CH), 5.18(s, 2H, PhCH2),7.42~7.26(m, 9H, ArH), 7.60(d,J=7.5 Hz, 2H, ArH), 7.76(d,J=7.5 Hz, 2H, ArH); IRν: 3 352, 2 964, 1 749, 1 719, 1 690, 1 528, 1 268, 1 252, 1 173, 738, 697 cm-1; ESI-MSm/z(%): 559{[M+1]+, 25}, 581{[M+23]+, 70}。

        (2)N-α-芴甲氧羰基-L-賴氨酸芐酯鹽酸鹽(3)的合成

        在圓底燒瓶中加入2 560 mg(1 mmol)和飽和HCl-EtOAc溶液6 mL,攪拌下于室溫反應1 h左右;打開瓶塞,攪拌至無白煙冒出;減壓旋蒸,殘余液用乙酸乙酯(2×5 mL)洗滌;加入冰乙醚,析出淡黃色固體,抽濾,濾餅真空干燥得粗品,經(jīng)硅膠柱層析[用V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯) ∶V(丙酮)=2 ∶1 ∶1~1 ∶1 ∶1作梯度洗脫]純化得白色固體3 0.433 g,收率87.8%, m.p.119.9 ℃~120.9 ℃;1H NMRδ: 1.26~1.64(m, 6H, b,c,d-H), 2.84~2.91(m, 2H, e-H), 4.10(m, 1H, a-H), 4.25~4.48(m, 3H, CO2CH2CH), 5.12(s, 2H, PhCH2), 7.28~8.18(m, 13H, ArH), 8.24(s, 3H, NH3); IRν: 3 323, 2 962, 1 720, 1 689, 1 526, 1 272, 1 251, 1 170, 737, 688 cm-1; ESI-MSm/z(%): 459{[M-HCl], 34}, 460{[M-HCl+1]+, 45}。

        (3) 4的合成

        在圓底燒瓶中加入3 494 mg(1 mmol)和二氯甲烷5 mL,攪拌下滴加Et3N 153 μL(1.1 mmol),滴畢,于室反應30 min。依次加入丁二酸酐0.156 g(1.5 mmol),吡啶121 μL(1.5 mmol),于室溫反應(TLC監(jiān)測)。用0.5 mol·L-1鹽酸(2×15 mL)洗滌后分出有機相,水相用二氯甲烷(2×10 mL)萃??;合并有機相,減壓蒸餾,加冰水(30 mL)后析出固體,抽濾得粗品538 mg,經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:A=2 ∶3)純化得白色固體4 0.469 g,收率78.5%, m.p.131.4 ℃~132.8 ℃;1H NMRδ: 1.31~1.69(m, 6H, b,c,d-H), 2.41~2.64(m, 4H, f,g-H), 2.84~2.90(m, 2H, e-H), 3.19~3.22(m, 2H, e-H), 4.02~4.07(m, 1H, a-H), 4.23~4.39(m, 3H, CO2CH2CH), 5.12(s, 2H, PhCH2), 7.33~7.78(m, 13H, ArH), 10.3(s, 1H, CO2H); IRν: 3 318, 2 954, 1 737, 1 689, 1 270, 1 257, 1 179, 737, 696 cm-1; ESI-MSm/z(%): 559[M, 24], 560{[M+1]+, 52}。

        (4) 5的合成

        在圓底燒瓶中加入4 278 mg(0.5 mmol)的二氯甲烷(5 mL)溶液,冰浴冷卻,攪拌下依次加入DIC 82 mg(0.6 mmol), HOBt 76 mg(0.6 mmol)和DIPEA 81 mg(0.6 mmol),反應30 min后撤去冰浴,再依次加入mPEG 3.0 g(0.5 mmol)和DMAP 7.0 mg(0.06 mmol),室溫反應(TLC監(jiān)測)。減壓蒸餾,殘余液加冰乙醚30 mL,析出白色固體,抽濾得粗品3.820 g,用混合溶劑[V(二氯甲烷) ∶V(乙醇)=1 ∶1]重結(jié)晶得白色固體4 2.780 g,收率84.8%, m.p.55.1 ℃~56.2 ℃; IRν: 3 316, 2 961, 2 888, 1 737, 1 702, 1 561, 744 cm-1。

        (5) 6的合成

        在圓底燒瓶中加入1 558 mg(1 mmol)和二氯甲烷10 mL,冰浴冷卻,攪拌下依次加入DIC 0.152 g(1.2 mmol)和HOBt 162 mg(1.2 mmol),攪拌30 min后撤去冰浴,依次加入mPEG 6.00 g(1 mmol)和DIPEA 155 mg(1.2 mmol),室溫反應(TLC監(jiān)測)。加水5 mL,抽濾,濾液用二氯甲烷萃取,合并有機層,用無水硫酸鈉干燥,減壓蒸餾。殘余液加冰乙醚60 mL,抽濾,濾餅用混合溶劑[V(DMF) ∶V(Et2O)=1 ∶8]重結(jié)晶得白色粉末6 6.043 g,收率93.7%, m.p.56.9 ℃~59.8 ℃; IRν: 3 317, 3 066, 2 959, 2 887, 1 720, 1 705, 1 688, 1 579, 743 cm-1。

        2 結(jié)果與討論

        為了得到長效多肽類藥物,目前各國學者主要采用化學修飾、基因融合、點突變及制劑改變等方法,其中化學修飾以其靈活多樣、簡便易行的特點而得到了廣泛的應用[11]。在使用的眾多修飾劑中,PEG應用最為普遍[12,13]。為此作者設(shè)計了主鏈、側(cè)鏈經(jīng)PEG修飾的新型賴氨酸衍生物5和6的合成。為了提高5和6的產(chǎn)率,本文對合成2~5的實驗條件進行了優(yōu)化。

        2.1 合成2的條件優(yōu)化

        氨基酸芐酯化的合成方法較多,既可以直接經(jīng)羧酸和醇的酯化反應(酸催化或偶聯(lián)試劑促進)、也可用羧酸鹽和鹵代烴的親核取代反應合成。作者參照文獻[14,15]方法合成2,并對其實驗條件進行優(yōu)化,結(jié)果見表1。從表1可以發(fā)現(xiàn),在室溫或回流溫度下,1與芐溴反應都能生成2,但是室溫反應20 h的收率只有50.7%,回流反應5 h的收率就達80.9%;時間延長(9 h)收率稍有提高(85%);若回流5 h后再在室溫反應11 h,不僅收率可超過90%,而且芐溴的氣味很淡。放大實驗證實了酯化條件的可靠性和穩(wěn)定性。

        2.2 合成3的條件優(yōu)化

        氨基酸脫Boc保護基,常見的試劑有TFA-CH2Cl2, HCl-EtOH及HCl-AcOEt等[14,16]?;诒狙芯渴业慕?jīng)驗,采用HCl-AcOEt飽和溶液脫除Boc保護基。實驗結(jié)果(表2)表明,1 mmol Fmoc-Lys(Boc)-OBzl約需HCl-AcOEt飽和溶液5 mL~7 mL,最佳反應時間為1.5 h。

        表1 反應溫度和時間對2收率影響Table 1 Effect of reaction temperature and time on yield of 2

        an(1 )=n(芐溴)=n(Et3N)=1.1 mmol;bn(1 )=n(芐溴)=n(Et3N)=2.2 mmol;cn(1 )=n(Et3N)=11 mmol,n(芐溴)=12 mmol;dn(1 )=n(芐溴)=n(Et3N)=22 mmol;其余反應條件同1.2(1)

        表2 3的制備條件及實驗結(jié)果*Table 2 Synthetic conditions and corresponding results of 3

        *反應條件同1.2(2)

        表3 4的制備條件及實驗結(jié)果*Table 3 Synthetic conditions and corresponding results of 4

        *3 1.1 mmol, 其余反應條件同1.2(3)

        2.3 合成4的條件優(yōu)化

        賴氨酸側(cè)鏈引入?;δ芑瓤刹捎娩逡宜狨?,也可選用丁二酸酐,雖然各有優(yōu)劣,但后者更為方便。本研究采用丁二酸酐法。表3顯示,在DCM中,丁二酸酐1.5倍投料,吡啶作催化劑,室溫反應4.5 h,收率達78.5%;當反應中不加吡啶催化,即使反應時間延長,收率也會有所降低。

        2.4 合成5的條件優(yōu)化

        表4 5的制備條件及實驗結(jié)果*Table 4 Synthetic conditions and corresponding results of 5

        *4 0.5 mmol,n(4) ∶n(DIC) ∶n(HOBt) ∶n(DIPEA) ∶n(mPEG) ∶n(DMAP)=1.0 ∶1.2 ∶1.2 ∶1.2 ∶1.0 ∶0.12;其余反應條件同1.2(4)

        羧基和氨基的偶聯(lián)反應,可選用的偶聯(lián)試劑很多[16]。本研究試用了DCC/HOBt, TBTU/HOBt, DIC/HOBt和HBTU/HOBt等偶聯(lián)劑,發(fā)現(xiàn)收率相差不大,但后處理卻以DIC/HOBt相對簡單。本實驗參照文獻[10,16]的合成方法,實現(xiàn)了5的合成,結(jié)果見表4。

        高分子修飾的5和6, ESI-MS只得到了分子量范圍,但符合高分子的譜圖特征;5與4相比,5的IR譜圖中νC-H顯著增強,而其它位置的吸收峰與4基本一致,由此判定該物質(zhì)含有較多的CH2CH2結(jié)構(gòu)單元,表明偶聯(lián)反應成功,確實得到了目標分子5;6的IR譜圖(略)中,顯示明確的酰胺鍵、羰基及苯環(huán),并且有很強的νC-H吸收,因此判定該物質(zhì)是Fmoc-Lys(Boc)-OmPEG。為了得到定量偶聯(lián)的結(jié)果,我們還采用氨基酸樹脂替代度測定法(紫外分光光度法),測定了它們的替代度[17],得知5和6的替代度分別為0.075和 0.124,這進一步支持了目標分子的結(jié)構(gòu)。

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        [17] 一般性方法(以5為例):稱取510 mg加入20%Piperdine-DMF(1 mL)溶液,振蕩20 min后再用兩個容量管各取DMF(10 mL), 向兩管中分別加入200 μL樣品溶液和20%Piperdine-DMF溶液;紫外分光光度計測其吸光度,取其301 nm處吸光度,由朗伯-比耳定律算出其替代度;最終可以定量的測出每1克樣品中含有多少毫摩爾5

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