敬 毅, 林文清, 張曉梅
(1. 中國(guó)科學(xué)院 成都有機(jī)化學(xué)研究所, 四川 成都 610041;2. 四川大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院 制藥與生物工程系,四川 成都 610041)
人類(lèi)基因組計(jì)劃[1]的完成是生物學(xué)發(fā)展的一個(gè)重要里程碑,該計(jì)劃的完成得益于DNA測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展。DNA序列分析對(duì)了解遺傳的本質(zhì)即了解每個(gè)基因的編碼方式十分重要。傳統(tǒng)的DNA測(cè)序方法有DNA末端合成終止法(Sanger法)[2]和化學(xué)降解法[3],這兩種方法具有簡(jiǎn)單、高效、精確和穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn),是目前應(yīng)用最為廣泛的方法。但是傳統(tǒng)的DNA測(cè)序方法難以滿(mǎn)足大型基因組計(jì)劃的高通量、高準(zhǔn)確度的要求。近年來(lái),人們對(duì)DNA測(cè)序方法不斷改進(jìn)和創(chuàng)新,發(fā)展了多種新興的測(cè)序技術(shù),測(cè)序通量急速增加,甚至達(dá)到傳統(tǒng)Sanger法的幾百至幾千倍,如基于合成法測(cè)序(SBS)的焦磷酸測(cè)序法[4],單分子實(shí)時(shí)DNA合成測(cè)序法[5]以及聚合酶克隆測(cè)序法[6]等。
最近,Jia Guo等[7]發(fā)展了一種綜合Sanger法和SBS法的測(cè)序方法,在這種測(cè)序方法中,需要對(duì)脫氧核苷的3′-羥基進(jìn)行暫時(shí)性的保護(hù),使得DNA聚合酶鏈反應(yīng)暫時(shí)中止,之后該保護(hù)基能以非常溫和的方法除去,以便繼續(xù)進(jìn)行DNA聚合酶鏈反應(yīng)。他們采用了一種非常有效的脫氧核苷的3′-羥基的保護(hù)方法,即以疊氮甲基保護(hù)β-胸苷(1)的3′-羥基得到3′-氧-疊氮甲基脫氧核苷(Ⅰ); Ⅰ中的3′-氧-疊氮甲基可以在三苯基膦作用下很方便地脫除。他們?cè)诤铣?′-氧-疊氮甲基-β-胸苷(5)時(shí),用價(jià)格昂貴的叔丁基二甲基氯硅烷保護(hù)5′-羥基。
Scheme1
為降低成本,本文在文獻(xiàn)[7]方法的基礎(chǔ)上對(duì)合成5的工藝進(jìn)行了改進(jìn)。嘗試以廉價(jià)易得的特戊酰氯(PivCl)代替叔丁基二甲基氯硅烷對(duì)1的5′-羥基進(jìn)行保護(hù)制得5′-氧-特戊酰基-β-胸苷(2);在DMSO和AcOH/Ac2O的作用下再將2的3′-羥基硫甲基甲基化制得5′-氧-特戊?;?3′-氧-硫甲基甲基-β-胸苷(3);然后以磺酰氯將3的硫甲基氯代,再與疊氮鈉反應(yīng),最后以碳酸鉀脫掉5′-羥基的特戊酰基,順利地合成了5(Scheme 1),其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR表征。改進(jìn)后的工藝路線(xiàn)具有反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)單、收率較高等優(yōu)點(diǎn)。
Bruker-300型核磁共振儀(CDCl3為溶劑,TMS為內(nèi)標(biāo))
吡啶和DMF使用前經(jīng)干燥處理;其余所用試劑均為市售化學(xué)純或分析純。
(1)2的合成
將124.22 g(100 mmol)和二甲氨基吡啶(DMAP)2.50 g(20 mmol)溶于250 mL干燥吡啶中,冷卻至-20 ℃后緩慢滴加PivCl 15.08 g(125 mmol),滴畢,于-20 ℃反應(yīng)24 h(TLC監(jiān)測(cè))。過(guò)濾,濾餅用少量吡啶洗滌,合并濾液,加水20 mL,于室溫?cái)嚢?0 min。旋蒸除吡啶,殘余物用二氯甲烷(200 mL)溶解,依次以飽和碳酸氫鈉溶液(100 mL)和飽和食鹽水(100 mL)洗滌,無(wú)水硫酸鈉干燥;旋蒸除溶,殘余物經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑:A=V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)=20 ∶1]分離得透明黏稠液體,經(jīng)油泵抽真空得白色泡狀固體2 30.91 g,產(chǎn)率94.7%;1H NMRδ: 1.23(s, 9H), 1.92(s, 3H), 2.06~2.10(m, 1H), 2.38(brs, 1H), 2.44~2.49(m, 1H), 4.18~4.27(m, 2H), 4.39~4.45(m, 2H), 6.30(t,J=6.4 Hz, 1H), 7.27(s, 1H), 9.07(s, 1H)。
(2)3的合成
將2 32.63 g(100 mmol)溶于200 mL DMSO中,攪拌下加入乙酸85 mL和乙酸酐275 mL,于40 ℃反應(yīng)72 h(TLC監(jiān)測(cè))。旋蒸除去大部分溶劑,殘余物用飽和碳酸氫鈉溶液中和至中性;用二氯甲烷(3×100 mL)萃取,合并有機(jī)層,依次以飽和碳酸氫鈉溶液(100 mL)和飽和食鹽水(100 mL)洗滌,無(wú)水硫酸鈉干燥;旋蒸除溶,殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:A=2 ∶1)分離得白色固體3 27.20 g,產(chǎn)率70.4%;1H NMRδ: 1.23(s, 9H), 1.91(s, 3H), 1.92~2.03(m, 1H), 2.13(s, 3H), 2.44~2.52(m, 1H), 4.20~4.25(m, 2H), 4.32~4.43(m, 2H), 4.59(d,J=11.8 Hz, 1H), 4.68(d,J=11.8 Hz, 1H), 6.24(dd,J=7.9 Hz, 5.9 Hz, 1H), 7.24(d,J=1.0 Hz, 1H), 9.39(s, 1H)。
(3) 5′-氧-特戊?;?3′-氧-疊氮甲基-β-胸苷(4)的合成
將3 38.65 g(100 mmol)溶于400 mL二氯甲烷中,于0 ℃~10 ℃緩慢滴加磺酰氯20.25 g(150 mmol),滴畢,于0 ℃~10 ℃反應(yīng)3 h(TLC監(jiān)測(cè))。旋蒸除溶后經(jīng)高真空除盡低沸點(diǎn)物質(zhì),殘余物用200 mL無(wú)水DMF溶解,加入疊氮鈉39.00 g(600 mmol),于室溫反應(yīng)5 h(TLC監(jiān)測(cè))。加入200 mL二氯甲烷,依次以飽和碳酸氫鈉溶液(100 mL)和飽和食鹽水(100 mL)洗滌,無(wú)水硫酸鈉干燥;旋蒸除溶,殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:A=2 ∶1)分離得白色固體4 23.16 g,產(chǎn)率60.7%;1H NMRδ: 1.23(s, 9H), 1.92(s, 3H), 2.04~2.10(m, 1H), 2.48~2.55(m, 1H), 4.22~4.38(m, 4H), 4.65(d,J=9.2 Hz, 1H), 4.74(d,J=9.2 Hz, 1H), 6.22(dd,J=7.8 Hz, 6.0 Hz, 1H), 7.22(s, 1H), 9.29(s, 1H)。
(4) 5的合成
將4 38.14 g(100 mmol)溶于200 mL甲醇中,攪拌下加入碳酸鉀27.64 g(200 mmol),于室溫反應(yīng)24 h(TLC監(jiān)測(cè))。用2 mol·L-1鹽酸調(diào)至pH 5左右,旋蒸除去大部分溶劑后用200 mL二氯甲烷充分溶解;冷卻至室溫,依次以飽和碳酸氫鈉溶液(100 mL)和飽和食鹽水(100 mL)洗滌,無(wú)水硫酸鈉干燥;旋蒸除溶,殘余物經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑:V(二氯甲烷) ∶V(甲醇)=6 ∶1]分離得白色固體5 29.02 g,產(chǎn)率97.6%;1H NMR (DMSO-d6)δ: 1.78(s, 3H), 2.22~2.29(m, 2H), 3.58~3.62(m, 2H), 3.93~3.95(m, 1H), 4.35~4.37(m, 1H), 4.85(s, 2H), 5.14(t,J=11.8 Hz, 1H), 6.13(dd,J=7.6 Hz, 6.4 Hz, 1H), 7.68(s, 1H), 11.31(s, 1H)。
本文以廉價(jià)易得的特戊酰氯代替叔丁基二甲基氯硅烷對(duì)β-胸苷的5-位羥基進(jìn)行保護(hù),經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)最后成功地合成了3′-氧-疊氮甲基-β-胸苷。在合成5′-氧-特戊?;?3′-氧-疊氮甲基-β-胸苷(4)時(shí),4須嚴(yán)格純化,否則最后一步脫保護(hù)不能定量反應(yīng),而且會(huì)造成最終產(chǎn)品純化困難,產(chǎn)品純度難以達(dá)到要求。
[1] Landers E S, Linton L M, Birren B,etal. Initial sequencing and analysis of the human genome[J].Nature,2001,409:860-921.
[2] Sanger F, Nicklen S, Coulson A R. DNA sequencing with chain-trminating inhibitors[J].Proc Natl Acad Sci,1977,74:5463-5467.
[3] Maxam A M, Gilbert W. A new method for sequencing DNA[J].Proc Natl Acad Sci,1977,74:560-564.
[4] Ronaghi M, Uhlen M, Nyrén P. A sequencing method based on real-time pyrophosphate[J].Science,1998,281:363-365.
[5] Harris T D, Buzby P R, Babcock H,etal. Single-molecule DNA sequencing of a viral genome[J].Science,2008,320:106-109.
[6] Mitra R D, Shendure J, Olejnik J,etal. Fluorescent in situ sequencing on polymerase colonies[J].Anal Biochem,2003,320:55-65.
[7] Guo J, Xu N, Li Z,etal. Four-color DNA sequencing with 3′-O-modified nucleotide reversible terminators and chemically cleavable fluorescent dideoxynucleotides[J].Proc Natl Acad Sci,2008,105:9145-9150.