蔡文濤，柳力，陳勇，韓鳳梅

(湖北大學(xué) 中藥生物技術(shù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430062)

原兒茶酸(protocatechuic acid，簡記為：PA)廣泛存在于無梗五加、葒草等常用中草藥中[1-2]，是一種水溶性酚酸成分，不僅具有顯著降低心肌耗氧量，提高心肌耐氧能力，減慢心率等藥理作用[3]，還有明顯抗乙型肝炎病毒(hepatitis B Virus，HBV)的作用．研究表明，原兒茶酸對(duì) HepG 2.215 細(xì)胞中HBV-DNA及抗原有較強(qiáng)抑制作用，對(duì)HBeAg的抑制作用要強(qiáng)于對(duì)HBsAg的抑制作用，且其作用機(jī)制不同于目前廣泛使用的核苷類似物[4]．目前關(guān)于原兒茶酸的藥動(dòng)學(xué)研究資料很少，僅有1篇文獻(xiàn)報(bào)道了大鼠單劑量給藥后其藥動(dòng)學(xué)[5]．文中研究低、中、高3個(gè)劑量的原兒茶酸對(duì)大鼠灌胃給藥后的藥代動(dòng)力學(xué)．

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1儀器Agilent 1100型 HPLC儀，DAD UV-Vis檢測器，Agilent Chemstation數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(Agilent公司)，BioTron Ecospin 3180C離心真空濃縮儀(BioTron公司)，Sigma 2K15C臺(tái)式高速離心機(jī)(Sigma 公司)，PHS-2C精密數(shù)顯酸度計(jì)(上海偉業(yè)儀器廠)．

1.2藥品與試劑原兒茶酸(純度≥98%，購于施瑞科技武漢有限公司)，對(duì)羥基苯甲酸(簡記為：PHBA，純度≥98%)，乙腈(色譜純)，Millipore超純水，肝素(150 U·mg-1)．

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí) Wistar大鼠：體重(200±20) g，雌雄各半，購于湖北省疾病預(yù)防控制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，合格證號(hào)：SCXK(鄂)2003-0005．

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1色譜條件色譜柱：Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(V∶V=14∶86，pH=2.1)；流速：1.2 mL/min；檢測波長：260 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：25 ℃．

2.2血漿樣品的處理精密量取血漿 200 μL, 加入 40 μL純水，20 μL 30 mg/L對(duì)羥基苯甲酸內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋振蕩 1 min，加 100 μL甲醇，500 μL乙腈，渦旋振蕩 1 min后[5]，12 000 r/min離心 10 min，取上清液置于離心真空濃縮機(jī)中 45 ℃揮干，殘?jiān)?100 μL流動(dòng)相復(fù)溶，12 000 r/min離心 5 min，取上清液 20 μL進(jìn)樣．

2.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)取SPF級(jí) Wistar大鼠 18 只，隨機(jī)分成 3 組，每組 6 只，雌雄各半，給藥前禁食 12 h，不禁水.按10 mL·kg-1量分別灌胃低、中、高劑量(合50、100、150 mg原兒茶酸/kg劑量)藥液，分別于給藥后10，20，30，45，60，75，90，120，180，300，480 min 眼底靜脈叢取血0.5 mL，立即移入經(jīng)肝素處理的 1.5 mL 離心管中，3 000 r/min 離心10 min，取血漿，于-20 ℃ 保存待測．

3 結(jié)果

3.1方法的專屬性在上述色譜條件下，測得空白血漿、加原兒茶酸和對(duì)羥基苯甲酸內(nèi)標(biāo)的空白血漿、大鼠灌胃原兒茶酸后的血漿樣品的色譜圖(圖 1)．由圖示，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)與原兒茶酸的可能代謝物不干擾原兒茶酸和對(duì)羥基苯甲酸內(nèi)標(biāo)的測定．

A：空白血漿

B：添加對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)的空白血漿

C：大鼠給藥后的血漿樣品

3.2線性范圍取大鼠空白血漿 200 μL，加入40 μL原兒茶酸系列對(duì)照品溶液，20 μL 30 mg/L對(duì)羥基苯甲酸內(nèi)標(biāo)溶液，配制成不同濃度的原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，除不加 40 μL 純水外，其余按2.2項(xiàng)操作，以原兒茶酸與對(duì)羥基苯甲酸的峰面積比值(Y)對(duì)原兒茶酸的濃度(X)作圖，得線性回歸方程為Y=0.179 8X+0.003 4，r=0.998(n=6)，線性范圍：0.15～80 mg/L，最低定量限為 0.15 mg/L(S/N>10)．

3.3精密度和準(zhǔn)確度配制含原兒茶酸0.5、3、20 mg/L(低、中、高)3 個(gè)濃度血漿樣品，連續(xù)測定 3 d.以當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算原兒茶酸的濃度，求得方法的精密度和準(zhǔn)確度，結(jié)果見表 1．

3.4提取回收率配制含原兒茶酸0.5、3、20 mg/L 3個(gè)濃度血漿樣品，以測得的目標(biāo)物的峰面積與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品峰面積的比值作為提取回收率，結(jié)果見表 2．

表 1 方法的精密度和準(zhǔn)確度

表 2 血漿中PA與PHBA的提取回收率

圖2 灌胃 50、100 和150 mg/kg 原兒茶酸后大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間曲線

3.5穩(wěn)定性配制含原兒茶酸0.5、3、20 mg/L 3 個(gè)濃度血漿樣品，分別置于室溫下保存 1 d和-20 ℃ 冰箱中保存 1 周后處理并測定，考察樣品的穩(wěn)定性．結(jié)果樣品測定的RE均小于5%，穩(wěn)定性良好．

3.6原兒茶酸在大鼠血漿中的藥代動(dòng)力學(xué)研究大鼠灌胃低、中、高3個(gè)劑量原兒茶酸的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖 2.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用3P97 藥代動(dòng)力學(xué)軟件進(jìn)行分析.根據(jù)擬和優(yōu)度值及 AIC 最小原則，結(jié)合測量值與估算值間的相關(guān)性、數(shù)據(jù)的精密度，得相關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表3，原兒茶酸在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過程符合二室開放模型，權(quán)重為1/C2．

表 3 大鼠單次灌胃 PA 50、100和150 mg/kg后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)±s)

4 討論

由圖1顯示灌胃原兒茶酸后的大鼠血漿樣品中有許多雜峰，經(jīng)DAD光譜掃描發(fā)現(xiàn)其紫外吸收?qǐng)D譜與原兒茶酸的極其相似，推測應(yīng)為其代謝物．我們?cè)么笫蟾挝⒘ｓw對(duì)原兒茶酸進(jìn)行體外溫孵代謝時(shí)，卻沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)代謝物.由于肝微粒體中主要是Ⅰ相代謝酶，故推測PA在大鼠體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化主要以Ⅱ相代謝為主．

本文中通過低、中、高3個(gè)劑量原兒茶酸在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PA灌胃劑量由 50 mg/kg增至 100 mg/kg時(shí)，AUC由(361±120)增至(3 492±767) mg·L-1·min、Cmax由(2.19±1.06)增至(30.41±7.27) mg·L-1，即劑量增加了1倍，而AUC增加了8.67倍，Cmax增加了12.89倍，CL從(0.14±0.04)下降至(0.03±0.01) mg·kg-1·min-1/mg·L-1.當(dāng)PA灌胃劑量由100 mg/kg增至 150 mg/kg時(shí)，AUC由(3 492±767)增至(5 218±1 860) mg·L-1·min、Cmax由(30.41±7.27)增至(49.33±28.43) mg·L-1，即劑量增加了0.5倍，而AUC增加了0.49倍(R2=1)，Cmax增加了0.62倍(R2=0.996 8)，CL基本不變，線性良好．

由以上數(shù)據(jù)對(duì)比知，原兒茶酸在劑量由 50 mg/kg增至 100 mg/kg時(shí)藥動(dòng)學(xué)過程呈現(xiàn)出非劑量依賴，隨著劑量的增加，AUC和Cmax增加得更快，而CL卻下降，表明體內(nèi)藥物清除變慢，藥物積蓄使AUC和Cmax急劇升高，說明在此劑量范圍，藥動(dòng)學(xué)過程呈非線性特征．原兒茶酸在劑量由 100 mg/kg增至 150 mg/kg時(shí)藥動(dòng)學(xué)過程呈現(xiàn)出劑量依賴，說明在此劑量范圍，藥動(dòng)學(xué)過程呈線性特征．

對(duì)于其產(chǎn)生非線性特征的原因，存在酶飽和等諸多因素，需要通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究確證．

我們?cè)芯苛嗽瓋翰杷釋?duì)小鼠的最大給藥量，結(jié)果表明給予最大容量最大濃度(5 g/kg)的原兒茶酸時(shí)，其毒性非常小，同時(shí)參考文獻(xiàn)[5]，文中設(shè)置上述低、中、高劑量．雖然原兒茶酸在大鼠體內(nèi)呈非線性藥動(dòng)學(xué)特征，推測其因給藥劑量變化而產(chǎn)生的毒副反應(yīng)的可能性較?。谶M(jìn)行臨床相關(guān)試驗(yàn)時(shí)，由于物種差異、生理病理狀況等復(fù)雜因素，還是有必要對(duì)其進(jìn)行血藥濃度的實(shí)時(shí)監(jiān)測．

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