王詠波 陳璐璐 田源 李燕

棕櫚酸對胰島β細(xì)胞激素敏感性脂肪酶的影響

王詠波 陳璐璐 田源 李燕

長期的高脂會造成胰島β細(xì)胞胰島素分泌障礙和三酰甘油(TG)的堆積，而過度堆積的TG是脂毒性的重要表現(xiàn)。

激素敏感性脂肪酶(HSL)是催化TG水解的限速酶，在胰島β細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和活化，并可能與胰島素分泌及β細(xì)胞TG堆積有關(guān)。但是高脂對HSL的影響并不十分清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)以不同濃度棕櫚酸培養(yǎng)胰島β細(xì)胞，觀察其HSL的變化。

一、材料和方法

1．細(xì)胞培養(yǎng)：NIT-1細(xì)胞株(來源于轉(zhuǎn)基因小鼠的胰島β細(xì)胞系)購于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，常規(guī)培養(yǎng)傳代。取對數(shù)生長期的NIT-1細(xì)胞，按1.0 ×106個(gè)/ml接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h,換含不同濃度棕櫚酸(0、0.125、0.25、0.5 mmol/L)的2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h。每種濃度、每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

2．胰島細(xì)胞TG含量測定：細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌、離心后置氯仿/甲醇 (2∶1 vol/vol)4℃過夜，3000 r/min離心15 min，棄上清后干燥，再溶于異丙醇,測定TG 含量。

3．HSL活性測定：將細(xì)胞分別加入含或不含10-5mol/L的異丙腎上腺素的PBS液中，置37℃溫浴1 h，3000 r/min離心15 min，取上清測定甘油的含量，它代表HSL的活性。甘油的測定按照試劑盒(Rochester公司)說明書操作。

4. HSL mRNA檢測：采用RT-PCR方法。用Trizol試劑(Invitrogen 公司)提取細(xì)胞總RNA。HSL引物上游5′-GGCTGGAACCAACCCTAG-3′,下游5′-AGTCCTTCATCACCCTCGA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物306 bp；內(nèi)參β-actin引物上游5′-CTGGCACCACACCTTCTACA-3′，下游5′-AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物758 bp，由上海博亞基因技術(shù)有限公司合成。cDNA合成反應(yīng)為42℃ 1 h；PCR反應(yīng)：94℃ 5 min，94℃ 60 s、50℃ 90 s、72℃ 60 s,36個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后掃描分析。

5．HSL蛋白檢測：采用Western blotting方法。收集培養(yǎng)的各組細(xì)胞,加入裂解緩沖液裂解細(xì)胞, 4℃離心,取上清，測蛋白濃度。取50 μg蛋白質(zhì)行Western blotting。用Labworks圖像分析系統(tǒng)掃描,以光密度值計(jì)算蛋白表達(dá)量。

二、結(jié)果

1．棕櫚酸對NIT-1細(xì)胞內(nèi)TG含量的影響：0、0.125、0.25和0.5 mmol/L棕櫚酸干預(yù)24 h后，TG含量分別為(3.25±0.42)pmol/106cell、(3.74±0.44)pmol/106cell、(4.35±0.58)pmol/106cell和(5.76±0.51)pmol/106cell；48 h后為(3.52±0.37)pmol/106cell、(4.03±0.55)pmol/106cell、(5.11±0.59)pmol/106cell和(6.54±0.47)pmol/106cell。

0.125 mmol/L組干預(yù)后48 h以及0.25 mmol/L和0.5 mmol/L組干預(yù)后24 h均較不加棕櫚酸組明顯增加(P<0.05)。

2．棕櫚酸對NIT-1細(xì)胞HSL mRNA和蛋白表達(dá)的影響：干預(yù)24 h時(shí)NIT-1細(xì)胞內(nèi)HSL mRNA和蛋白的表達(dá)隨著棕櫚酸濃度的增加而逐漸增加；干預(yù)48 h時(shí)0.25 mmol/L組HSL mRNA和蛋白的表達(dá)量最高(圖1、2)。

圖1 棕櫚酸干預(yù)NIT-1細(xì)胞24(a)、48 h(b)時(shí)HSL mRNA的表達(dá)

圖2棕櫚酸干預(yù)NIT-1細(xì)胞24(a)、48 h(b)細(xì)胞HSL蛋白表達(dá)

討論游離脂肪酸(FFA)作為胰島素分泌的信號分子，短時(shí)間內(nèi)(<3～6 h)升高可促進(jìn)基礎(chǔ)和葡萄糖刺激后胰島素分泌(GSIS)[1-2]，而長時(shí)間(>24 h)的高FFA則產(chǎn)生脂毒性，抑制GSIS，引起β細(xì)胞凋亡[3-6]。這主要是由飽和脂肪酸引起[7]。因此本實(shí)驗(yàn)采用體外棕櫚酸(飽和脂肪酸)干預(yù)來研究高脂對胰島細(xì)胞的HSL及脂質(zhì)的影響。

Winzell等[8]報(bào)道，高脂喂養(yǎng)的小鼠，血漿FFA升高，胰島TG堆積，胰島素分泌障礙， HSL表達(dá)先升高后下降，說明了高脂對HSL的早期調(diào)節(jié)，也證實(shí)了脂毒性的存在。胰島HSL表達(dá)的下調(diào)可能是機(jī)體為減少TG水解，減少脂肪酸的產(chǎn)生，減輕脂毒性，對脂肪酸介導(dǎo)的胰島細(xì)胞功能障礙作出的自身保護(hù)性反應(yīng)。Winzell等[9]采用HSL過表達(dá)轉(zhuǎn)基因鼠來研究HSL與胰島β細(xì)胞脂毒性的關(guān)系。與野生鼠相比，HSL過表達(dá)鼠在接受高脂飲食后，表現(xiàn)出胰島細(xì)胞中TG含量減少，葡萄糖耐量異常，GSIS障礙。推測HSL過表達(dá)鼠在長期高脂飲食下不能適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)HSL，HSL持續(xù)刺激細(xì)胞內(nèi)TG分解，加重了脂毒性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著棕櫚酸濃度增加和干預(yù)時(shí)間的延長，細(xì)胞內(nèi)TG含量也呈現(xiàn)出增加趨勢。同時(shí)，HSL mRNA 和蛋白的表達(dá)也增加，與Winzell等[8]的結(jié)果相似。

文獻(xiàn)報(bào)道[10-11]，F(xiàn)FA促進(jìn)HSL表達(dá)的同時(shí)卻抑制了HSL的活性。本結(jié)果顯示棕櫚酸的干預(yù)對HSL活性并無影響。Hu等[12]認(rèn)為，在相同條件下，F(xiàn)FA對脂肪組織脂解表現(xiàn)為抑制，而對胰島細(xì)胞表現(xiàn)為促進(jìn)。但他們強(qiáng)調(diào)了LC-CoA在胰島素分泌中的重要作用，而忽略了細(xì)胞內(nèi)長期高LC-CoA對胰島細(xì)胞的毒性作用。本實(shí)驗(yàn)脂解沒有明顯增加可能正是長期高LC-CoA對胰島細(xì)胞的毒性作用的表現(xiàn)，只是FFA對胰島細(xì)胞脂解的抑制作用出現(xiàn)得更緩慢一些。

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430022，武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科(王詠波現(xiàn)在大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科)

陳璐璐，Email:cheria_chen@sohu.com

2009-04-02)