殷濤 冷振偉 楊智勇 吳河水 王春友

·論著·

Bmi-1在胰腺癌組織中的表達(dá)及其意義

殷濤 冷振偉 楊智勇 吳河水 王春友

目的檢測(cè)Bmi-1在胰腺癌組織中的表達(dá)，分析其與胰腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系。方法實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)22例手術(shù)切除的新鮮胰腺癌組織及配對(duì)癌旁組織中Bmi-1 mRNA的表達(dá)；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)61例胰腺癌石蠟塊標(biāo)本中Bmi-1、p16蛋白的表達(dá)，并分析與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。結(jié)果22例胰腺癌組織中Bmi-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.314±0.040，與配對(duì)的癌旁組織0.143±0.056的表達(dá)量相差顯著(P<0.01)。61例胰腺癌組織中36例(59.0%)Bmi-1蛋白表達(dá)陽性，34例(55.7%)p16蛋白表達(dá)缺失。胰腺癌組織Bmi-1的陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P=0.025)；p16的表達(dá)缺失與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移(P=0.020)及腫瘤分化程度(P=0.018)相關(guān)；Bmi-1蛋白表達(dá)與p16蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P=0.033)。結(jié)論Bmi-1在胰腺癌組織中表達(dá)增加，它可能通過抑制p16表達(dá)調(diào)控胰腺癌的惡性生物學(xué)行為。

胰腺腫瘤； 干細(xì)胞因子； Bmi-1; 基因，p16; 表達(dá)

胰腺癌干細(xì)胞學(xué)說認(rèn)為，胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展可能是由特定的腫瘤干細(xì)胞樣亞群維系的，一些過度活化的信號(hào)通路通過調(diào)控胰腺癌干細(xì)胞的異?；罨M(jìn)而導(dǎo)致胰腺癌高度惡性的生物學(xué)行為。Bmi-1是新近發(fā)現(xiàn)的Polycomb蛋白家族成員，也是一種重要的腫瘤干細(xì)胞因子， 它在包括胰腺癌在內(nèi)的多種腫瘤中異常表達(dá)，并調(diào)控腫瘤的進(jìn)展[1]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Bmi-1及其下游基因p16在胰腺癌中的表達(dá)，探討其與腫瘤臨床病理指標(biāo)間的相關(guān)性。

材料與方法

一、組織標(biāo)本

收集2000年至2006年我院手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查證實(shí)的胰腺癌石蠟塊標(biāo)本61例。其中37例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，9例有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；高分化19例，中分化16例，低分化26例。另取3例正常胰腺組織、5例慢性胰腺炎(CP)組織標(biāo)本作為對(duì)照。同時(shí)收集22例手術(shù)切除的新鮮的胰腺癌組織以及配對(duì)的癌旁組織，置液氮保存。

二、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Bmi-1、p16蛋白表達(dá)

SP免疫組化試劑盒購自福州邁新公司，嚴(yán)格按照試劑說明書操作。 PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。 鼠抗人Bmi-1多克隆抗體、兔抗人p16多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，DAB顯色試劑盒購自北京中山生物技術(shù)公司。結(jié)果判定：胞核或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為Bmi-1蛋白陽性表達(dá)，在×200光鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞，以陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分計(jì)算，<10%為陰性，≥10%為陽性。以胞膜和胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為p16蛋白陽性表達(dá)， ≤5%為p16表達(dá)缺失，>5%為p16陽性表達(dá)。

三、熒光定量PCR法檢測(cè)Bmi-1 mRNA表達(dá)

采用Trizol(Life Technologies公司)法提取總RNA。 通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA，然后行熒光定量PCR。Bmi-1引物為：正義：5′-CTGGTTGCCCATTGACAGC-3′，反義5′-CAGAAAATGAATGCGAGCCA-3′；在FTC-2000型熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃ 10 min，94℃ 30 s ，51℃ 30 s，72℃ 30 s。50個(gè)循環(huán)。Bmi-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT法[2]計(jì)算。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

p16、Bmi-1相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)，表達(dá)量的差異性分析采用t檢驗(yàn)，P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

結(jié) 果

一、Bmi-1 mRNA在胰腺癌組織中的表達(dá)

22例胰腺癌組織Bmi-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.314±0.040，而配對(duì)的癌旁組織Bmi-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.143±0.056，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.758,P<0.0001)。

二、Bmi-1蛋白表達(dá)及與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系

Bmi-1表達(dá)于細(xì)胞的胞核和胞質(zhì)。胰腺癌組織Bmi-1蛋白陽性表達(dá)率為59.0%(36/61，圖1)。正常胰腺、癌旁組織及CP組織的Bmi-1均陰性表達(dá)。

胰腺癌組織Bmi-1蛋白表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性，僅與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。37例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中26例Bmi-1蛋白表達(dá)陽性，24例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中10例Bmi-1蛋白表達(dá)陽性，兩者相差顯著(P=0.025，表1)。

三、p16 蛋白的表達(dá)及與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系

正常胰腺組織中p16蛋白表達(dá)陽性。 61例胰腺癌組織中34例(55.7%)p16蛋白表達(dá)缺失(圖2)，27例(44.3%) p16蛋白陽性表達(dá)。p16的表達(dá)缺失與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移(P=0.02)及腫瘤分化程度(P=0.018)相關(guān)(表2)。

圖1Bmi-1在胰腺癌中的陽性表達(dá)( ×100)圖2p16在胰腺癌中表達(dá)缺失( ×100)

表1 胰腺癌組織Bmi-1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

注：aP<0.05

表2 胰腺癌組織p16 蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

注：aP< 0.05

四、胰腺癌Bmi-1和p16蛋白表達(dá)的相關(guān)性

34例p16缺失表達(dá)的胰腺癌組織中，24例Bmi-1蛋白表達(dá)陽性；27例p16陽性表達(dá)的胰腺癌組織中，12例Bmi-1表達(dá)陽性。兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.033)，同時(shí)兩者呈負(fù)相關(guān)。

討 論

最初發(fā)現(xiàn)Bmi-1與癌基因c-myc協(xié)同在鼠淋巴瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮作用[3]。隨后的研究證實(shí)，Bmi-1通路可以調(diào)控白血病干細(xì)胞、乳腺癌干細(xì)胞的增殖和自我更新能力[4-5]。 現(xiàn)已證實(shí)，胰腺癌干細(xì)胞的Bmi-1呈活化狀態(tài)[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Bmi-1mRNA或蛋白在胰腺癌組織中的表達(dá)量都較高，而正常胰腺及CP中則呈陰性表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)Bmi-1信號(hào)通路在胰腺癌組織中處于異?；罨癄顟B(tài)。同時(shí)胰腺癌Bmi-1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，表明它參與調(diào)控胰腺癌的惡性生物學(xué)行為。

p16是一種細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控蛋白，通過對(duì)細(xì)胞周期依賴激酶CDK的抑制，干擾pRb蛋白的磷酸化，阻滯細(xì)胞周期于G1期。p16在多種惡性腫瘤組織的表達(dá)呈抑制狀態(tài)。本組55.7%的胰腺癌組織p16表達(dá)缺失，并與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移以及腫瘤分化程度相關(guān)，提示p16的缺失參與了胰腺癌的進(jìn)展。

p16是Bmi-1的重要靶基因，Bmi-1的過度活化可導(dǎo)致p16的異常沉默[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示，胰腺癌組織Bmi-1的高表達(dá)，而p16的表達(dá)被抑制。當(dāng)然Bmi-1的作用方式非常復(fù)雜，它可不依賴于INK4A/ARF[8]而與其他信號(hào)通路如NF-κB、PI3K-Akt等協(xié)同作用調(diào)控腫瘤惡性生物學(xué)行為[9-10]。

[1] Li C,Heidt DG,Dalerba P,et al.Identification of pancreatic cancer stem cells.Cancer Res,2007,67:1030-1037.

[2] Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.Methods,2001,25:402-408.

[3] Jacobs JJ,Scheijen B,Voncken JW,et al. Bmi-1 collaborates with c-Myc in tumorigenesis by inhibiting c-Myc-induced apoptosis via INK4a/ARF. Genes Dev,1999,13:2678-2690.

[4] Liu S,Dontu G,Mantle ID,et al.Hedgehog signaling and Bmi-1 regulate self-renewal of normal and malignant human mammary stem cells. Cancer Res,2006,66:6063-6071.

[5] Lessard J,Sauvageau G.Bmi-1 determines the proliferative capacity of normal and leukaemic stem cells.Nature,2003,423:255-260.

[6] Lee CJ,Dosch J,Simeone DM. Pancreatic cancer stem cells.J Clin Oncol,2008,26:2806-2812.

[7] Kim JH,Yoon SY,Kim CN,et al.The Bmi-1 oncoprotein is overexpressed in human colorectal cancer and correlates with the reduced p16INK4a/p14ARF proteins.Cancer Lett,2004,203:217-224.

[8] Xu CR,Lee S,Ho C,et al.Bmi1 functions as an oncogene independent of Ink4A/Arf repression in hepatic carcinogenesis.Mol Cancer Res,2009,7:1937-1945.

[9] Li J,Gong LY,Song LB,et al.Oncoprotein Bmi-1 renders apoptotic resistance to glioma cells through activation of the IKK-nuclear factor-kappaB Pathway. Am J Pathol,2010,176:699-709.

[10] Datta S,Hoenerhoff MJ,Bommi P,et al.Bmi-1 cooperates with H-Ras to transform human mammary epithelial cells via dysregulation of multiple growth-regulatory pathways.Cancer Res,2007,67:10286-10295.

2010-01-28)

(本文編輯：屠振興)

ExpressionandsignificanceofBmi1inpancreaticcarcinoma

YINTao,LENGZhen-wei,WUHe-shui,WANGChun-you.

CenterofPancreasSurgery.UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China

YINTao,Email:whuh608@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the expression and significance of Bmi-1 in pancreatic cancer.MethodsThe expression of Bmi-1 mRNA was detected in pancreatic cancer and matched adjacent normal tissues by using real-time PCR in 22 cases of human pancreatic carcinoma. Bmi-1 and p16 protein were determined in 61 cases of human pancreatic carcinoma with immunohistochemistry and their relationship with clinicopathologic parameters was analyzed.ResultsThe expression of Bmi-1 mRNA was 0.314±0.040 in cancerous tissues, and 0.143±0.056 in adjacent normal tissues, and the difference was statistically significant (P<0.01). 36 cases (59.0%) of PC were detected with positive expression of Bmi-1 protein, and 34 cases (55.7%) with no expression of p16 protein. The expression of Bmi-1 was significantly correlated with lymph node metastasis (P=0.020) and tumor differentiation (P=0.018); the expression of Bmi-1 was negatively correlated with the expression of p16 (P=0.033).ConclusionsExpression of Bmi-1 was increased in pancreatic cancer, which may be involved in the malignant behavior of pancreatic cancer by inhibiting p16 expression.

Pancreatic neoplasms; Stem cell factor; Bmi-1; Genes,p16; Expression

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.06.018

國家自然科學(xué)基金(30801100)；湖北省生物靶向治療研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放研究課題(2007B09)

430022 湖北武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院胰腺外科中心(殷濤、楊智勇、吳河水、王春友)；湖北省生物靶向研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(殷濤)；華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院腔鏡外科中心(冷振偉)

殷濤，Email:whuh608@yahoo.com.cn