黃浩杰 高軍 杜奕奇 龔燕芳 呂順莉 王小瑋 許愛平 高飛 李兆申

·論著·

RADIL基因在胰腺癌組織中的表達及其臨床意義

黃浩杰 高軍 杜奕奇 龔燕芳 呂順莉 王小瑋 許愛平 高飛 李兆申

目的探討胰腺癌組織中RADIL基因的表達及其與臨床病理特征之間的相關(guān)性。方法采用實時定量PCR方法檢測40例胰腺癌及相應癌旁組織和5例正常胰腺組織中RADIL mRNA相對表達量，分析RADIL mRNA表達與胰腺癌臨床病理特征之間的相關(guān)性。結(jié)果RADIL mRNA在胰腺癌組織、癌旁組織及正常胰腺組織中均有表達，相對表達量分別為2.263±3.826、5.425±8.858和8.559±4.214，三組之間存在顯著差異(P<0.05)。癌組織中RADIL mRNA高表達與腫瘤遠處轉(zhuǎn)移、分化程度呈負相關(guān)(r為-0.312和-0.294，P值均<0.05)，與腫瘤部位、腫瘤大小、血清CA19-9濃度、TNM分期及患者的性別和年齡均無顯著相關(guān)性。結(jié)論RADIL基因?qū)σ认侔┛赡芫哂幸欢ǖ囊种谱饔谩?/p>

胰腺腫瘤； 小GTP結(jié)合蛋白質(zhì)類； 實時熒光定量聚合酶鏈式反應； RADIL基因

我們前期采用甲基化芯片對胰腺癌組織進行篩查，提示RADIL基因在胰腺癌組織中為高甲基化狀態(tài)。復習文獻后發(fā)現(xiàn)對其研究較少，僅見其參與細胞黏附、遷移過程的報道。人類RADIL基因編碼一個1075氨基酸的蛋白，包括RA、DIL和PDZ三個功能域[1]。RADIL結(jié)構(gòu)域的架構(gòu)非常類似AF6，AF6為膜結(jié)合蛋白和細胞骨架肌動蛋白的媒介物，具有細胞黏附調(diào)解功能[2]。本研究檢測RADIL在胰腺癌組織和癌旁組織及正常胰腺組織中的表達，分析其與胰腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系。

材料和方法

一、材料

組織標本取自第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院2006年7月至2008年8月期間住院手術(shù)治療的40例胰腺癌患者，其中男性28例，女性12例，年齡35～76歲，平均(57±9)歲，每例取癌和癌旁組織(距腫瘤切緣5 cm)標本各1份，并與患者簽訂知情同意書。5例正常胰腺組織為本實驗室既往保存標本。經(jīng)病理學檢查證實，腫瘤組織中癌細胞數(shù)量均大于50%，癌旁組織中未見癌細胞。所有標本獲取后迅速置于液氮中保存。同時，收集患者臨床資料，包括性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、臨床分期、遠處轉(zhuǎn)移和血清CA19-9濃度。

二、方法

1．引物設計與合成：從GenBank查獲基因序列，使用軟件Primer Premier 5.0進行設計。RADIL上游引物為5′-TCTTGATCCAGGAATTATGGAAACC-3′，下游引物為5′-TTATCCCTGCCGTGATGGTGT-3′，擴增片段120 bp;GAPDH上游引物為5′- ACATCAAGAAGG-TGGTGAAGCA-3′；下游引物為5′-TCAAAGGTGGAG-GAGTGGGT-3′，擴增片段118 bp，引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

2．RNA提取和cDNA合成：采用Trizol(GibcoBRL公司)試劑抽提組織總RNA。應用分光光度法測定RNA含量及純度，1.5%瓊脂糖電泳以進一步檢測RNA質(zhì)量。采用PrimeScriptTM RT試劑盒(TaKaRa公司)行逆轉(zhuǎn)錄反應，應用隨機引物進行cDNA合成。

3．實時定量PCR： 采用TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT-PCR試劑盒在ABI7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)中進行實時定量PCR檢測。反應系統(tǒng)：SYBR?Premix Ex TaqTM II(2×)10μl，上、下游引物(10 μM)各0.8 μl，滅菌蒸餾水 6.4 μl,cDNA模板2 μl。PCR條件：95℃ 10 s，95℃ 5 s、60℃ 34 s，40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參照，以去核酸無菌水作為陰性對照，腫瘤組織CH06為相對定量計算參照樣。RADIL mRNA的相對表達定量(RQ)用2-ΔΔCT計算。

三、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、RADIL mRNA在胰腺組織中的表達

RADIL mRNA在胰腺癌組織、胰腺癌旁組織和正常胰腺組織中均有表達(圖1)，其相對表達量分別為2.263±3.826、5.425±8.858和8.559±4.214，癌組織的RADIL mRNA顯著低于癌旁組織，癌旁組織的RADIL mRNA表達又顯著低于正常胰腺組織(P值均<0.05，圖2)。

1～2：胰腺癌組織；3～4：胰腺癌旁組織；5～6：正常胰腺組織

圖2RADIL mRNA在胰腺癌組織、癌旁組織和正常胰腺組織的表達

二、RADIL mRNA表達與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系

RADIL mRNA的表達與胰腺癌的遠處轉(zhuǎn)移、分化程度呈負相關(guān)(P值均<0.05)，與腫瘤部位、腫瘤大小、CA19-9水平、TNM分期及患者的性別、年齡均無顯著相關(guān)性(表1)。

討 論

RADIL編碼蛋白包括RA、DIL和PDZ域。既往研究發(fā)現(xiàn)，RA功能域存在于許多Ras和Rap通路下游作用因子中，這兩種GTPase在體內(nèi)相互作用；DIL域功能不清楚，僅發(fā)現(xiàn)其存在于許多細胞骨架相關(guān)蛋白中；C端的PDZ域在C羧基端具有代表性的蛋白-蛋白相互作用結(jié)構(gòu)[1]。

參數(shù)例數(shù)RADILmRNA表達量r值P值性別 男282.630±4.425-0.0080.953 女121.408±1.643年齡400.0430.794CA19-940-0.1700.295腫瘤大小40-0.0990.545腫瘤部位 胰頭272.517±4.349-0.0020.988 胰體尾131.737±2.479局部浸潤范圍 T1～T2332.312±4.001-0.1340.310 T3～T472.035±3.056淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無262.183±3.169-0.0560.671 有142.413±4.956遠端轉(zhuǎn)移 無382.382±3.891-0.3120.018 有20.220±0.003TNM分期 Ⅰ～Ⅱ252.232±3.224-0.0540.685 Ⅲ～Ⅳ152.316±4.791分化程度 高分化112.252-0.2940.025 中分化292.338±3.925 低分化101.049±1.663

RADIL作為Rap GTPase下游效應器，在細胞遷移和黏附中扮演關(guān)鍵性角色。Rap屬于小分子G蛋白Ras超家族成員之一。根據(jù)Rap蛋白氨基酸組成不同，Rap被分成Rap1和Rap2。Rapl的兩個亞型(RaplA和RaplB)在氨基酸序列上具有97%的同源性，且與Ras蛋白有高度同源性,常將二者通稱為Rapl。Rap2和Rapl有70%的同源性，但二者功能有明顯差異[3-4]。

Rapl和其他G蛋白一樣，表現(xiàn)為無活性的GDP結(jié)合形式和有活性的GTP結(jié)合形式兩種構(gòu)象。Rapl由GDP結(jié)合的無活性形式轉(zhuǎn)變?yōu)镚TP結(jié)合的活性形式是由鳥苷酸交換因子(GEFs)催化完成的[5-6]。GEFs使G蛋白分子中的GDP釋放，由于細胞內(nèi)GTP濃度遠遠高于GDP濃度，GTP取代GDP位置。GTP的結(jié)合導致小分子G蛋白分子的構(gòu)象改變，介導其與下游靶蛋白作用。一系列的上游信號分子(如Ca2+/鈣調(diào)蛋白、二乙酰甘油、cAMP和受體酪氨酸激酶)通過與GEFs結(jié)合使Rapl活化[7]。

本實驗結(jié)果顯示，胰腺癌組織RADILmRNA的表達明顯低于癌旁正常胰腺組織和正常胰腺組織，表明胰腺癌組織的RADILmRNA是低表達的。在胰腺癌組織中，低分化和有轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織中的表達又明顯低于中高分化和無轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織，進一步說明RADILmRNA的表達與胰腺癌的惡性程度相關(guān)，提示RADIL基因?qū)σ认侔┛赡芫哂幸职┳饔谩?/p>

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2010-04-02)

(本文編輯：呂芳萍)

ExpressionandclinicalimplicationsofRADILgeneinpancreaticcancer

HUANGHao-jie,GAOJun,DUYi-qi,GONGYan-fang,LVShun-li,WANGXiao-wei,XUAi-ping,GAOFei,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LIZhao-shen,Email:zhsli@81890.net

ObjectiveTo investigate the RADIL mRNA expression in pancreatic carcinoma and to evaluate its clinical significance.MethodsFluoesecent quantitative PCR (FQ-PCR) was used to detect the RADIL mRNA expression in 40 patients with pancreatic carcinoma and adjacent tissue and in 5 healthy adult with normal pancreatic tissue and to observe its relationship with clinicopathologic parameters.ResultsRADIL mRNA was expressed in pancreatic carcinoma and adjacent tissue, as well as normal pancreatic tissue, and the relative expression was 2.263±3.826, 5.425±8.858 and 8.559±4.214, respectively.There was statistically significant difference among the three groups (P<0.05). RADIL mRNA expression was closely related with the metastasis and differentiation grade (r=-0.312 and -0.294,P<0.05), however, it was not significantly related to tumor site, tumor size, CA19-9, TNM staging, sex and age.ConclusionsRADIL gene may have an inhibitory effect on the pancreatic cancer.

Pancreatic neoplasms; Small GTP binding proteins; Fluorescent quantitative PCR; RADIL genes

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.06.015

國家科技支撐支持(2006BAI02A12)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院消化內(nèi)科(黃浩杰、高軍、杜奕奇、龔燕芳、呂順莉、王小瑋、許愛平、高飛、李兆申)；沈陽軍區(qū)總醫(yī)院內(nèi)窺鏡科(高飛)

李兆申，Email:zhsli@81890.net