李鋮璐,杜鵬飛,裴曉林,吳慧麗,謝開林,王秋巖

(杭州師范大學(xué) 生物醫(yī)藥與健康研究中心，浙江 杭州 310012)

0 前 言

2-脫氧-D-核糖-5磷酸醛縮酶(2-deoxy-D-ribose 5-phosphate aldolase, DERA, EC 4.1.2.4)是一種特殊的裂解酶，參與多種微生物的DNA代謝路徑，可以催化其天然底物乙醛和D-甘油醛-3-磷酸可逆的醛縮反應(yīng)形成D-2-脫氧-5-磷酸.這種酶可以在醛縮底物上引入多個(gè)手性中心，這個(gè)特點(diǎn)使它成為合成多種稀有糖和糖衍生物的有力工具[1].Wong和其同事在1994年報(bào)道了“醛縮酶催化三分子乙醛的不對(duì)稱醛縮反應(yīng)”.這個(gè)反應(yīng)能夠在其合成產(chǎn)物中形成新的碳碳鍵并且可以引入最多兩個(gè)手性中心，其內(nèi)酯產(chǎn)物可以被用作重要的他汀中間體使用(見反應(yīng)式1[2]).今天，作為降血脂的3-hydroxy3-methylglutary (HMG)-CoA還原酶抑制劑的他汀類藥物是世界上最為暢銷的全合成藥物，年銷售額可以達(dá)到上百億美元[3].這里值得一提的是醛縮反應(yīng)是一個(gè)平衡的過(guò)程，四碳的中間產(chǎn)物形成是可逆的，在這個(gè)中間產(chǎn)物與另一分子乙醛第二次醛縮時(shí)，因?yàn)樽詈笮纬闪谁h(huán)化內(nèi)酯，這會(huì)驅(qū)動(dòng)反應(yīng)平衡不斷向最終產(chǎn)物進(jìn)行.這個(gè)反應(yīng)具備的主要優(yōu)點(diǎn)是，可以用價(jià)格低廉的乙醛作為原料，一步形成具有兩個(gè)手性中心的六碳中間體.因?yàn)檫@個(gè)酶催化路徑如此的有吸引力，人們?yōu)榱碎_發(fā)出更為高效的醛縮酶付出了很多努力.到目前為止，研究者已經(jīng)純化和表征了來(lái)源于E.coliK12,Klebsiellapneumoniae,Lactobacillusplantarum,Salmonellatyphimurium,StreptococcusmutansGS-5,Yersiniasp.EA015,Aeropyrumpernix,Pyrobaculumaerophilum和Thermotogamaritime的DERA[2,4-11].另有報(bào)道采用理性設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)了一個(gè)帶有S238D突變的醛縮酶突變體，這個(gè)突變體可以接納新的醛類分子作為它的底物，可以方便的與后續(xù)母環(huán)進(jìn)行對(duì)接，這個(gè)突變體合成阿托伐他汀側(cè)鏈分子的反應(yīng)比野生型更為高效[12].Greenberg和他的同事也從環(huán)境樣品中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的醛縮酶，在放大反應(yīng)中，該酶對(duì)乙醛衍生物表現(xiàn)出比大腸桿菌醛縮酶更好的耐受性[13].Jennewein等采用定向進(jìn)化技術(shù)，獲得了一個(gè)與野生型相比較體現(xiàn)出10倍增長(zhǎng)的氯乙醛抗性的突變體[14].依靠強(qiáng)大的基因工程和蛋白質(zhì)工程手段，盡管人們?cè)谌┛s酶耐乙醛變性的功能改進(jìn)上，已取得很大進(jìn)步，但仍然需要更多的途徑，尤其是更為便捷的途徑獲取抗乙醛變性的醛縮酶.

生物催化劑-酶的穩(wěn)定性，尤其是耐有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性，在工業(yè)中特別是在精細(xì)化工和醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用，一直是受到關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題[15-16].來(lái)源于嗜熱微生物的酶具有很高的熱穩(wěn)定性，這種熱穩(wěn)性質(zhì)與包括洗滌劑和有機(jī)溶劑等變性劑條件下的穩(wěn)定性有正向相關(guān)性.人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多來(lái)源于極端古菌微生物的蛋白酶，在高溫條件下，甚至同時(shí)存在高濃度洗滌劑和變性劑條件下仍然保持穩(wěn)定[17-19].在混合緩沖液和水有機(jī)溶劑混合體系中，比如乙腈和二甲基亞砜中，來(lái)源于嗜熱微生物A.pernix,P.calidifontis和S.tokodaii的酯酶表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性[20].Hao等的工作表明，一種定向進(jìn)化獲得的熱穩(wěn)果糖二磷酸醛縮酶，同樣在有機(jī)溶劑中也表現(xiàn)出增強(qiáng)了的穩(wěn)定性[21].這種被證明了的熱穩(wěn)定性和耐有機(jī)溶劑性質(zhì)的正向相關(guān)性，使得嗜熱微生物來(lái)源的醛縮酶，有可能成為需要耐受高濃度乙醛底物的工業(yè)醛縮反應(yīng)的良好候選者.

在該實(shí)驗(yàn)中，筆者克隆和過(guò)表達(dá)了Geobacillusthermodenitrificans的耐熱醛縮酶，對(duì)其進(jìn)行了初步的酶學(xué)性質(zhì)的表征，并測(cè)量了該酶的熱穩(wěn)定性和耐乙醛抗性，結(jié)果表明，該酶具備良好的熱穩(wěn)定性，同時(shí)對(duì)高濃度乙醛的耐受能力較好.進(jìn)一步的連續(xù)醛縮活力的測(cè)定表明，其連續(xù)醛縮活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于來(lái)源于常溫大腸桿菌的醛縮酶.

反應(yīng)式1 DERA催化的連續(xù)醛縮反應(yīng)Scheme 1 Sequential aldol reactions catalyzed by DERA

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

pET-303/CT-His從Novagen (Madison, WI, USA)購(gòu)買獲得，大腸桿菌BL21-CodonPlusTM-RIL (DE3)菌株為該實(shí)驗(yàn)室保存.大腸桿菌DERA酶(DERAEco), 2-脫氧-D-核糖-5磷酸(2-Deoxy-D-Ribose-5-Phosphate，DRP), triose-phosphate isomerase和glycerol-3-phosphate dehydrogenase均從sigma公司購(gòu)買，其它化學(xué)試劑均是分析級(jí)別.

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

來(lái)自嗜熱微生物Geobacillusthermodenitrificans的醛縮酶核苷酸序列從基因數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得.其基因編碼的蛋白質(zhì)序列被命名為DERAGth.該全長(zhǎng)編碼序列由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行全基因合成.基因5端的起始密碼子前引入一個(gè)唯一的XbaI限制性酶切位點(diǎn)，同時(shí)，3`端引入XhoI限制性酶切位點(diǎn)并替代終止密碼子.合成的基因用XbaI和XhoI進(jìn)行酶切，再與同樣使用XbaI和XhoI酶切后的線性pET303/CT-His載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-DERA，重組質(zhì)粒采用常規(guī)化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化BL21-CodonPlusTM-RIL (DE3).

1.3 純化與表達(dá)

攜帶DERA基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，轉(zhuǎn)化子在1 mL LB培養(yǎng)基中37 ℃生長(zhǎng)1 h后，再涂布于含氨芐霉素(100 mg/L)的LB固體平板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)獲得單克隆.挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化子在含氨芐霉素(100 mg/mL)的100 mL LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)(37 ℃, 220 r/min).培養(yǎng)至光學(xué)密度達(dá)到0.6，加入0.5 mmol IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)在37 ℃培養(yǎng)5 h.11 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，-80 ℃反復(fù)凍融3次后，在100 mmol phosphate, 200 mmol sodium chloride(pH7.5)緩沖液中重新懸浮，重復(fù)上離心步驟后取上清液.攜帶His-tag的DERA酶液使用Ni柱親和層析純化獲得，操作按照鎳柱純化手冊(cè)進(jìn)行(Ni-Sepharose HP, Amersham Biosciences, Freiburg, Germany).酶液冷凍干燥獲得酶粉，并在-80 ℃儲(chǔ)存.SDS-PAGE電泳檢測(cè)酶的純化情況.Bradford法進(jìn)行確定蛋白濃度.

1.4 序列分析

使用CLUSTALW軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，除該研究中的醛縮酶序列外，又選取了來(lái)源于其它嗜熱微生物具有代表性的3個(gè)DERA序列，分別為來(lái)自嗜熱微生物A.pernix,P.aerophilum和T.maritime.序列信息來(lái)源于UniProtKB/TrEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)應(yīng)的Accession Numbers 如下:A.pernix, Q9Y948;P.aerophilum, Q8ZXK7;以及T.maritima, Q9X1P5.

1.5 基本酶學(xué)性質(zhì)表征

DRP分解活性測(cè)定按照文獻(xiàn)進(jìn)行[11].每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol NADH的酶量定義為1個(gè)酶活單位.在不同的pH條件下進(jìn)行反應(yīng)，同樣按照文獻(xiàn)描述的活力測(cè)定方法進(jìn)行，確定酶的最適pH.所用的緩沖液及梯度如下：sodium acetate (0.1 M, pH 3.0～pH 6.0), imidazole-HCl (0.1 M, pH 6.0～pH 7.5), triethanolamine-HCl (0.1 M, pH 7.5～pH 8.5) 和 glycine-NaOH (0.1 M, pH 8.5～pH 11.0). 最適溫度在20—100 ℃區(qū)間內(nèi)選取不同溫度條件下進(jìn)行反應(yīng)，同樣按照文獻(xiàn)描述的活力測(cè)定方法進(jìn)行，確定酶的最適反應(yīng)溫度.

1.6 熱穩(wěn)定性與耐乙醛穩(wěn)定性

同樣為0.5 mg/mL的酶在最適緩沖液中，在20—100 ℃區(qū)間內(nèi)選取不同溫度條件下溫浴10 min，應(yīng)用上述DRP分解活性方法測(cè)定殘余活性.酶在自身的最適緩沖液中，同時(shí)添加乙醛至終濃度為300 mmol，在25 ℃下溫浴.在一定的時(shí)間間隔后使用上述DRP分解活性測(cè)定方法測(cè)定其殘余的活性.

1.7 連續(xù)醛縮活力

連續(xù)醛縮反應(yīng)通過(guò)薄層色譜法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析.50 μL的反應(yīng)混合物包括100 mmol目標(biāo)酶的最適緩沖液, 300 mmol乙醛和23 μg的醛縮酶.在25 ℃反應(yīng)4 d后，反應(yīng)通過(guò)冰上終止，離心去除蛋白.2 μL的濾液進(jìn)行TLC分析.展開溶劑為1-butanol, acetic acid和H2O比例為4∶1∶1(vol/vol/vol)，反應(yīng)生成物的斑點(diǎn)通過(guò)茴香醛試劑顯色.

圖1 重組蛋白SDS-PAGE電泳Fig. 1 SDS-PAGE analysis of recombinant DERAs from G. thermodenitrificans

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白表達(dá)和純化

DERAGth在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了過(guò)量表達(dá)，全菌體電泳結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的蛋白量明顯高于誘導(dǎo)前，經(jīng)過(guò)鎳柱純化后，目標(biāo)蛋白電泳為單一條帶(圖1).經(jīng)鎳柱純化回收，回收效率接近40%(表1).

表1 蛋白質(zhì)純化過(guò)程回收效率

2.2 序列分析

序列多重比對(duì)結(jié)果表明：DERAGth與其它嗜熱微生物來(lái)源代表性的醛縮酶相比，彼此的氨基酸序列相似度比較低.但是形成Schiff-base的基本催化殘基位點(diǎn)Lys126，在所有比對(duì)的醛縮酶中是完全保守的.活性位點(diǎn)Asp91和Lys154，因在質(zhì)子的傳遞系統(tǒng)中起著重要作用，在所有比對(duì)序列中也是保守的(圖2).

圖2 蛋白質(zhì)序列比對(duì)Fig. 2 Amino acid sequence alignment of DERAs from G. thermodenitrificans A. pernix (Q9Y948),P. aerophilum (Q8ZXK7), and T. maritima (Q9X1P5)

2.3 基本酶學(xué)性質(zhì)

最適pH的表征結(jié)果表明，DERAGth的最適pH為7.5，從最適pH的曲線中可以看到，DERAGth在pH9.5附近還有另外一個(gè)鐘形頂點(diǎn)存在(圖3)，這表明該酶活性中心附近存在強(qiáng)電荷殘基，根據(jù)第二個(gè)鐘性頂點(diǎn)出現(xiàn)在pH9.5附近，推測(cè)其活性位點(diǎn)周圍最可能存在其它的如His、Lys或Arg殘基，這些殘基的帶電基團(tuán)發(fā)生了解離，進(jìn)而疊加影響了活性中心殘基的解離系數(shù)，表現(xiàn)為雙鐘形pH曲線.DERAGth是目前為止唯一一個(gè)具有雙鐘形pH曲線的DERA醛縮酶.最適溫度的測(cè)定表明，該酶的最適溫度為60 ℃.在不同溫度下保溫10 min，可以看到該酶的熱穩(wěn)定性較高，在60 ℃保溫10 min后，酶活性完全沒(méi)有損失，但是70 ℃條件下活力處于完全失活狀態(tài)(圖4).與目前已經(jīng)克隆和表征的常溫醛縮酶相比較[9,11]，該酶熱穩(wěn)定性上表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)，但是與P.aerophilum和T.maritime來(lái)源的嗜熱醛縮酶相比[11]，其穩(wěn)定性稍差，后兩者在90 ℃下保溫10 min活力仍然保持在100%.

圖3 pH值對(duì)活力的影響Fig. 3 Effects of pH on activities of DERAGth

圖4 溫度-活力曲線圖Fig. 4 Effects of temperature on stability(●) and activity(■) of DERAGth

2.4 乙醛耐受性

乙醛的耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該酶在300 mmol乙醛濃度下，30 min內(nèi)保持了高于50%的剩余活力，在經(jīng)過(guò)2 h后，其剩余活力仍大于40%，到達(dá)4 h后剩余活力下降為20%，其后至20 h不再出現(xiàn)下降.從其活力下降的曲線可以看到，在0—1 h的區(qū)間內(nèi)，活力下降速度最高，1 h內(nèi)下降了約60%，但是在1—8 h的區(qū)間內(nèi)，平均每小時(shí)活力下降不超過(guò)3%(圖5)，這表明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，大量的乙醛底物被醛縮酶轉(zhuǎn)化為內(nèi)酯產(chǎn)物，降低了變性劑乙醛的濃度，進(jìn)而導(dǎo)致酶失活速率的下降.與來(lái)源于P.aerophilum和T.maritime的DERA相比較，DERAGth的耐乙醛變性能力稍弱，但是P.aerophilum和T.maritimeDERA的耐乙醛實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在同樣條件下，后兩者進(jìn)入變性速率下降階段至少要需要3 h[11]，由此可以推斷在催化乙醛轉(zhuǎn)化為內(nèi)酯的速率上，來(lái)源于P.aerophilum和T.maritime的DERA催化速率要比DERAGth低.后續(xù)的連續(xù)醛縮活力的薄層色譜結(jié)果也提示，盡管DERAGth在穩(wěn)定性上稍遜色于后兩者，在同樣高濃度乙醛條件下，三者的連續(xù)醛縮產(chǎn)物的量處于一個(gè)相當(dāng)?shù)乃?，都遠(yuǎn)大于大腸桿菌來(lái)源的醛縮酶[11].

2.5 連續(xù)醛縮活力

為了進(jìn)一步確定DERAGth的連續(xù)醛縮性能，筆者通過(guò)薄層色譜法檢測(cè)其內(nèi)酯產(chǎn)物的大致含量.同時(shí)，將連續(xù)醛縮性能研究最為詳細(xì)的大腸桿菌醛縮酶作為對(duì)照組，結(jié)果顯示在25 ℃條件下，經(jīng)過(guò)4 d的暗室反應(yīng).由薄層色譜結(jié)果可以看到，大腸桿菌的目標(biāo)條帶中基本看不到產(chǎn)物，而DERAGth的產(chǎn)物目標(biāo)條帶已經(jīng)非常明顯(圖6).同樣，文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)P.aerophilum和T.maritime的醛縮酶也在相同條件下與大腸桿菌比較過(guò)連續(xù)醛縮活力，其結(jié)果與在實(shí)驗(yàn)中確定的結(jié)果是類似的，嗜熱來(lái)源的醛縮酶活力都明顯高于大腸桿菌來(lái)源的常溫醛縮酶[11].

圖5 乙醛對(duì)酶穩(wěn)定性的影響Fig. 5 Effect of acetaldehyde on enzyme stability

圖6 連續(xù)醛縮的產(chǎn)物薄層色譜分析Fig. 6 TLC analysis of the products of aldol condensation by DERAs

3 結(jié) 論

該實(shí)驗(yàn)克隆、表達(dá)和初步表征了來(lái)源于Geobacillusthermodenitrificans的嗜熱醛縮酶DERAGth，作為嗜熱來(lái)源的醛縮酶，DERAGth的熱穩(wěn)定性方面與國(guó)際上已報(bào)道的嗜熱醛縮酶相比并無(wú)優(yōu)勢(shì)，但是在對(duì)抗乙醛變性的實(shí)驗(yàn)中，該酶表現(xiàn)出較高的乙醛耐受和對(duì)乙醛底物的轉(zhuǎn)化活力，兩者共同作用表現(xiàn)在高濃度乙醛催化反應(yīng)中內(nèi)酯產(chǎn)物的高產(chǎn)量.因此綜合考慮其對(duì)乙醛的較好抗性和較高活力的分子性質(zhì)，DERAGth可以作為開發(fā)催化乙醛底物連續(xù)醛縮反應(yīng)工業(yè)工藝一個(gè)比較理想的催化劑選擇起點(diǎn)，期望可以通過(guò)進(jìn)一步的酶固定化、蛋白質(zhì)工程和反應(yīng)介質(zhì)優(yōu)化等手段，將DERAGth開發(fā)為可以工業(yè)應(yīng)用的催化劑.

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