王家福,劉尚高

(1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京 海淀100193;2.寧波天邦股份有限公司,浙江 余姚315400)

豬流行性感冒(swine influenza,SI)是由豬流行性感冒病毒(SIV)引起的豬的一種急性、熱性和高度接觸性的呼吸道傳染病,其臨床上以突發(fā)高熱、咳嗽、呼吸困難、衰竭和死亡為特征[1]。豬流感呈地方性流行,世界分布,可發(fā)生于各年齡和各品種豬,發(fā)病率可高達100%[2]。豬是禽流感、豬流感、人流感病毒共同的易感宿主,三種病毒極易發(fā)生重組、變異,產(chǎn)生新的毒株危害人畜生命及安全。因此,豬流感在人和動物流感的病原學、生態(tài)學及流行病學中占有相當重要的地位[3]。對豬流感的防制不僅可以減少對養(yǎng)豬業(yè)造成的直接經(jīng)濟損失,而且也能降低出現(xiàn)其他新流感病毒的可能性,采用疫苗來預防豬流感,是降低損失和出現(xiàn)新流感病毒可能性的主要措施之一[1]。國外已研制出了滅活疫苗,弱毒疫苗,亞單位苗,并在開展基因工程苗的研制工作[5]。國內(nèi)尚無正式上市的疫苗。

1 材料與方法

1.1 種毒 自 2002年開始,先后從河北、河南、山東、黑龍江、江蘇、安徽、內(nèi)蒙等地送檢的病豬呼吸道病料以及暴發(fā)SI的病豬群內(nèi)采集癥狀典型或病死豬的鼻氣管、分泌物用PBS制成懸液,以3 000 r/min離心20 min,吸取上清,加雙抗搖勻滅菌處理,作為接種材料并做無菌檢驗,合格者接種10日齡SPF雞胚,35℃孵育,盲傳3代,收集尿囊液進行血凝活性測定。血凝活性HA≥1∶128即可進行病毒鑒定。

對上述毒株作了系統(tǒng)的鑒定工作,如理化特性、血清學鑒定、特異性鑒定、電鏡觀察、外源病原檢測、抗原相關性試驗,并經(jīng)中國疾病預防控制中心病毒預防控制所國家流感中心進行血凝素(H)、神經(jīng)氨酸酶(N)的系統(tǒng)鑒定,證明它為豬流感H 1N1、H 3N2亞型,分別定名為L、S毒株。

經(jīng)測定,其 EID50≥107.5/0.1 mL。HI抗體幾何平均值≥7log2,病毒分離,對照組至少4/5病毒分離陽性,免疫組全部保護。經(jīng)特異性和純凈性檢驗合格。

1.2 試驗豬 SIV H1N1、H 3N2亞型 HI抗體均為陰性的2月齡仔豬,購自武川縣畜牧局豬場。

1.3 雞胚 SPF雞胚,發(fā)育良好的10日齡非免疫易感雞胚。

1.4 濃縮、乳化設備 并聯(lián)分體式濃縮超濾裝置、膠體磨JTM 50、勻漿泵。

1.5 其他 藥用白油、司本-80、硬脂酸鋁。

1.6 毒液制備 按規(guī)程草案規(guī)定的生產(chǎn)工藝接種收獲胚液并按照“標準”附錄P.301的方法對胚液進行無菌檢查,應無細菌生長。對10日齡易感雞胚尿囊腔內(nèi)接種EID≥107.5/0.1 mL,胚液對1%雞紅細胞凝集價≥1∶256。符合以上規(guī)定的方可作為制苗用病毒液。

1.7 抗原濃縮 取2種制苗用毒液,分別在無菌條件下過濾,除去尿囊液殘渣和其他粗顆粒雜質(zhì)。然后分別進行濃縮。濃縮前和濃縮后,用測血凝價HA或 EID50方法進行檢查,確定濃縮終點是EID50≥5×108.0/0.1 mL。濃縮后的病毒應達到濃縮終點的要求,對濃縮過程中的廢棄液進行檢查,檢查其EID50、HA價或TCID50等均應為零值。

1.8 滅活 經(jīng)濃縮后的2種病毒液,分別加入0.1%分析純甲醛,經(jīng)37℃16 h滅活處理。滅活后的病毒液,分別接種SPF雞胚,進行 HA、EID50測定。同時按“標準附錄”P.301的方法作無菌檢驗。

1.9 乳化與分裝 2種抗原液按1∶3(水相∶油相)比例先分別乳化成單項苗。再將單項苗等體積混合,經(jīng)勻漿機充分混合均勻,即成二價苗。分裝、加塞、壓蓋,2℃～8℃保存。

1.10 疫苗檢驗

1.10.1 物理性狀 劑型：將3批三價苗滴于冷水表面,不分散為W/O型,分散為O/W型。

黏度：用出口內(nèi)徑為1.2 mm的1 mL吸管,在室溫條件下吸1 mL二價苗,計算垂直放出0.4 mL所需的時間。

穩(wěn)定性：將二價苗以3 000 r/min離心15 min,觀察疫苗分層情況。或?qū)⒍r苗分別置4℃冰箱,室溫(20℃～25℃以下),37℃溫度條件下觀察分層情況。

1.10.2 無菌檢驗 按“生物制品質(zhì)量標準”附錄P.301的方法對3批二價苗進行無菌檢驗,并觀察結(jié)果。

1.10.3 安全試驗 用 2月齡SIV(L、S株)抗體陰性的仔豬,肌肉注射二價苗6 mL,觀察3周,并記錄試驗豬的反應情況。

1.10.4 效力檢驗 每批疫苗接種2月齡SIV抗體陰性仔豬5頭,每頭肌肉注射疫苗2.0 mL,同時設同條件下不接種疫苗的對照仔豬5頭,21 d后采血,分離血清,用SIV亞型抗原測定HI抗體效價,免疫組HI抗體幾何平均滴度應≥7log2,對照組均為陰性?；?qū)⑸鲜龈鹘M仔豬于免疫28 d后,用SIV亞型強毒,經(jīng)10倍稀釋,每頭仔豬滴鼻和肌肉注射2.0 mL,攻毒5 d后,采集鼻腔拭子進行病毒分離。每頭仔豬的樣品尿囊腔接種10日齡SPF雞胚5個。孵育觀察5日,無論死胚、活胚均應測定雞胚液血凝價,以5個雞胚中至少有1個雞胚的血凝價≥1∶16判為感染。觀察并記錄結(jié)果,對照組至少4頭分離到病毒,免疫組應完全保護。

1.10.5 不同免疫劑量試驗 3批苗分別各用1、2、3、4 mL肌肉注射2月齡SIV抗體陰性仔豬。同時設不免疫對照組。1個月后,對免疫豬和對照豬用L、S強毒株(EID50≥107.5/0.1 mL)2 mL鼻腔滴鼻和肌肉注射,1周后兩組仔豬采鼻腔拭子、用SPF雞胚分離病毒。判定。

2 結(jié)果

2.1 毒液制備 制備出符合要求的SIV 2種亞型毒液。經(jīng)測定,2株雞胚尿囊液的病毒含量≥107.5EID50/0.1 mL,HA≥1∶256;2種病毒液經(jīng)無菌檢驗均無菌生長,符合制苗的要求。

2.2 毒液濃縮 濃縮后的毒液采用檢查EID50和HA效價的方法,證明濃縮效果明顯,HA≥2 048,均提高了16倍;廢棄排放液中均不含病毒。

2.3 毒液滅活 滅活后的病毒液,分別接種SPF雞胚,進行HA、EID50測定,均未引起雞胚死亡,其EID50和HA均為0,證明雞胚液均無血凝活性和致病性,病毒已徹底滅活。

2.4 乳化分裝 滅活的病毒液按照水相：油相1∶3比例,分別乳化后再混合,制備出理想的二價滅活疫苗。

2.5 檢驗

2.5.1 物理性狀 劑型：3批樣品分別滴于冷水表面,不分散,為W/O(油包水)型。

黏度：用出口內(nèi)徑1.2 mm的1 mL吸管,在室溫條件下吸1 mL二價苗,垂直放出0.4 mL所需的時間分別為7～8 s,符合“質(zhì)量標準”要求。

穩(wěn)定性：3批苗以3 000 r/min離心 15 min,不分層、不破乳。在4℃保存13個月,20℃以下保存6個月,疫苗不分層;37℃保存1個月不分層;保存2個月疫苗表面有2 mm左右的油層,搖蕩后即成均勻的乳劑。

2.5.2 無菌檢驗 無菌檢驗結(jié)果所制3批試驗疫苗均無菌生長,均合格。

2.5.3 安全試驗 觀察3周,所有試驗仔豬精神良好,吃食正常。3周后撲殺,觀察注射部位、腎臟、氣管及內(nèi)臟的變化,所有臟器未見異常變化,少數(shù)仔豬注射局部有輕微炎性反應,或有少量未吸收疫苗。證明該3批試驗疫苗使用安全。

2.5.4 效力試驗 免疫仔豬均為陰性,而對照仔豬病毒分離至少4頭陽性。結(jié)果見表1。

表1 效力檢驗結(jié)果

2.5.5 不同免疫劑量試驗 1 mL免疫總保護為33.3%。2 mL免疫總保護100%。3 mL免疫總保護為100%。4 mL免疫總保護100%。而對照組為0%,并分離到病毒。因此,最小有效免疫劑量仔豬定為2 mL,大豬定為3～4 mL。結(jié)果見表2。

表2 不同免疫劑量試驗結(jié)果

3 結(jié)語

3.1試制成功豬流感2個亞型毒株二價滅活疫苗。從該疫苗經(jīng)物理性狀檢驗、無菌檢驗、安全檢驗和效力檢驗結(jié)果看,2個制苗種毒的免疫原性和穩(wěn)定性良好,適合作疫苗用毒株。所設計的生產(chǎn)工藝簡便易行,適合于規(guī)?；a(chǎn)。疫苗符合“試行規(guī)程”(草案)規(guī)定。

3.2 生產(chǎn)工藝中的濃縮技術(shù)先進,效果穩(wěn)定。濃縮過程中隨時抽樣檢測濾出液的HA效價,并將濃縮即將完成時的濾出液接種雞胚檢測有無活病毒濾出,結(jié)果表明,濃縮過程中沒有抗原成分損失。從濃縮前后胚液中抗原含量檢測結(jié)果看,HA效價與濃縮倍數(shù)成正相關;EID50均有所提高。用濃縮后的胚液配苗,疫苗中抗原成分的含量均可達到或高于相應單苗的標準。

[1] Barbara E Strawt.豬病學[M].趙德明,張仲秋,沈建忠,主譯.9版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社,2008：522-523,528-530.

[2] Marozin S,Gregory V,Cameron K.Antigenic and gengtic diversity among.swine influenza A H1N1and H1N2viruses in Europe[J].Gen Virol J,2002,83：735-736.

[3] Nerome K,Yoshioka Y,Sakamoto S.Characterization of a 1980-Swine recombinant influenza virus possessing H1 haemagglutinin and N2 neuraminidase similar to that of the earliest Hong Kong(H3N2)virus[J].Arch Virol,1985,86：197-199.

[4] Swenson S L,Foley P L,Swine influenza.In Manual of Diagnostic Tests and Vaccinesfor Terreststrial Animals[M].Office International des Epizooties.World Organisation for Animal Health,2004：1111-1112.