孫 晴

(臨沂師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,山東臨沂276005)

在人和動物的機(jī)體內(nèi)存在著完整的黏膜免疫系統(tǒng)。黏膜免疫要取得好的免疫效果,關(guān)鍵是免疫佐劑的使用。比較理想的黏膜佐劑應(yīng)高效、安全,能激活黏膜免疫系統(tǒng)[1]。Protollin黏膜佐劑是由福氏2a痢疾桿菌中提取的脂多糖(LPS)[2]與B群2b型腦膜炎奈瑟雙球菌的外膜蛋白中提取的蛋白體[3]非共價結(jié)合制備而來的。蛋白體具有免疫佐劑作用,主要原因是蛋白體中的主要成分PorB(Ⅱ類膜蛋白)可與Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2)相互作用。TLRs能夠識別侵入體內(nèi)的微生物進(jìn)而激活免疫細(xì)胞應(yīng)答[4]。被認(rèn)為在先天性免疫系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用。而福氏2a痢疾桿菌的LPS可與Toll樣受體4相互作用,也能調(diào)節(jié)天然免疫。所以研究制備Protollin黏膜佐劑具有非常重要的現(xiàn)實意義[7]。

1 材料

1.1 主要試劑 酚(AR),由天津市化學(xué)試劑廠生產(chǎn);蒽酮(AR),中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn);BCA蛋白濃度檢測試劑盒,購于碧云天試劑公司。

1.2 菌種及診斷液 福氏2a痢疾桿菌、福氏2a痢疾桿菌群Ⅱ型診斷血清和蛋白體(由B群2b型腦膜炎奈瑟雙球菌29353菌株提取),由臨沂師范學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室保存。

1.3 實驗動物 Balb/c小鼠,雌性,6～18周齡。購自山東臨沂魯南制藥廠實驗動物中心。

2 方法

2.1 LPS的提取方法 采用熱酚水法,方法步驟見參考文獻(xiàn)[6]。

2.2 LPS的脫毒[3]及檢測[4]LPS的脫毒檢測用14%SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳銀染色法。

2.3 LPS中某些物質(zhì)的檢測

2.3.1 蛋白質(zhì)含量的測定 用牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,系列稀釋,具體操作參照BCA法試劑盒說明書,然后做標(biāo)準(zhǔn)曲線,測出LPS提取物的OD值,從標(biāo)準(zhǔn)曲線找出其蛋白含量。

2.3.2 糖含量的測定[8]取一定量的LPS,用蒽酮法從標(biāo)準(zhǔn)曲線中找出其糖含量。

2.4 異常毒性試驗 將體重20 g左右的Balb/c小鼠18只隨機(jī)分成3組,每組6只,分別稱重。1、2兩組分別腹腔注射0.5 mL含1 mg和2 mg的LPS,第3組設(shè)為對照組,腹腔注射0.5 mL生理鹽水,連續(xù)觀察14 d。在觀察期內(nèi)小鼠應(yīng)全部健存,無異常反應(yīng),每只小鼠體重增加,判為合格。

2.5 蛋白體的提取及鑒定 見參考文獻(xiàn)[3]。

2.6 Protollin佐劑的制備[5]將去毒的LPS溶于TEEN緩沖液中,與等量的蛋白體混合,加入4倍體積的冷無水乙醇,收集沉淀,再用無水乙醇洗3次,最后用無菌蒸餾水溶解,超聲使蛋白體與LPS相互結(jié)合和溶解,溶液 1 000 r/min離心10 min,去除不可溶的物質(zhì),可溶的為Protollin佐劑。

2.7 Protollin佐劑效果試驗

2.7.1 免疫雙擴(kuò)試驗[3]。

2.7.2 動物試驗 選6～18周齡Balb/c小鼠,雌性,隨機(jī)分為 3組,每組 5只,Protollin+YscF組：每只15μL YscF+5μL Protollin;Protollin對照組：5μL Protollin;YscF 組：每只 15μL YscF。所有小鼠滴鼻初免后每隔7 d加強(qiáng)免疫1次,共免疫3次,每次免疫后第7天尾靜脈采血,用ELISA方法檢測抗體滴度。

3 結(jié)果與分析

3.1 LPS脫毒檢測結(jié)果 從SDS-PAGE銀染色(見圖1),福氏2a痢疾桿菌LPS有兩條條帶,分別是85 ku和43 ku。而泳道1為脫毒LPS未見到明顯的染色條帶。說明將福氏2a痢疾桿菌LPS經(jīng)脫毒得到LPS中不含類脂A部分。在Protollin中也沒有LPS條帶,只有蛋白體條帶。

圖1 SDS-PAGE銀染色圖

3.2 LPS與 Protollin中某些物質(zhì)的檢測 經(jīng)SDS-PAGE檢測脫毒LPS蛋白質(zhì)含量為0.024 g/L;糖含量為0.34 g/L。Protollin佐劑中多糖含量為0.357 g/L,蛋白質(zhì)含量為0.517 g/L均符合生物制品安全標(biāo)準(zhǔn)要求。

3.3 Protollin佐劑效果

3.3.1 免疫雙擴(kuò)試驗 脫毒后的LPS和Protollin佐劑分別與福氏2a痢疾桿菌群Ⅱ型血清能形成明顯的沉淀線,說明脫毒后的LPS和Protollin佐劑均保存了LPS良好的反應(yīng)原性。

3.3.2 動物試驗 結(jié)果顯示(見圖2)：在免疫接種2周和4周后檢測Yscf+Protollin組的抗體滴度明顯高于 Yscf組和Protollin對照組。說明制備的Protollin佐劑具有良好的免疫效果,且能夠增強(qiáng)Yscf的免疫原性。

圖2 Protollin佐劑免疫小鼠后血清IgG抗體滴度

4 討論

4.1 福氏2a(S.f lex neri 2a)痢疾桿菌是一種致病菌,從中提取LPS用作疫苗佐劑的成分,其安全性是首要的。本試驗嚴(yán)格按照《中國生物制品規(guī)程》的各項要求對 LPS進(jìn)行安全性檢測。所獲得的LPS其純度均符合要求[9]。將福氏 2a痢疾桿菌LPS與純化后的蛋白體佐劑非共價結(jié)合制成Protollin佐劑,保持了多糖完好的反應(yīng)原性。

4.2 本試驗對制備的Protollin佐劑作進(jìn)一步的動物學(xué)試驗和抗體滴度檢測,結(jié)果證明,制備的Protollin佐劑具有良好的免疫活性,能夠增強(qiáng)Yscf的免疫原性。Protollin佐劑的安全性在文獻(xiàn)[10]中證實,通過鼻內(nèi)免疫嚙齒類動物和靈長類動物的試驗,證明疫苗是安全,無毒性,有持久效果,并且具有很高的免疫原性和免疫保護(hù)效果。所以Protollin佐劑將成為一種很有潛力的黏膜佐劑。隨著研究的深入將會在傳染性疾病的防治中發(fā)揮廣泛而重要的作用。

[1] Mayer L.Mucosal immunity and gastrointestinal antigen p rocessing[J].J Pediatr Gastroenterol Nutr,2000,30(suppl)：4-12.

[2] 潘勁草,黃志成,余文炳,等.腸出血性大腸桿菌O157：H7脂多糖抗原的制備及鑒定[J].中國人獸共患病雜志,1999,15(3)：59-61.

[3] 吳秀芳,王棟,邢麗,等.疫苗蛋白體佐劑的研制[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志 ,2006,26(12)：1085-1086.

[4] Frenkel D,Puckett L,Petrovic S,et al.A nasal proteosome ad juvant activates microglia and prevents amyloid dep osition[J].Animal of Neurology,2008,63(5)：591-601.

[5] Chabot S,Brewer A,Lowell G,et al.A novel intranasal ProtollinTM-based measles vaccineinduces mucosal and systemic neutralizing antibody responses and cell-mediated immunity in mice[J].Vaccine,2005,23(11)：1374-1383

[6] Orr N,Robin G,Cohen D,et al.Immunogenicity and efficacy of oral or intranasal Shigella flexneri 2a and shigella sonnei proteosome-lipopolysaccharide vaccines in animal models[J].Infect Immun,1993,61(6)：2390-2395.

[7] 郝亞寧,馬永平.關(guān)于黏膜免疫佐劑的研究現(xiàn)狀[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志 ,2009,21(7)：661-663.

[8] Jones T,Cy r S,Allard F,et al.Protollin TM：a novel adjuvant for intranasal vaccines[J].Vaccine,2004,22(27)：3691-3697.

[9] Hu M C,Jones T,Kenney R T,et al.Intranasal Protollinformulated recombinant SARSS-protein elicits respiratory and serum neutralizing antibodies and protection in mice[J].Vaccine,2007,25(34)：6334-6340.

[10]Tsai C M.The analysis of lipopolysaccharide(endotxin)in Meningococcal polysaccharide vaccines by silver staining following SDS-polyacrylaminde gel electrophoresis[J].J Biol,1986,14(1)：25-33.