戴四發(fā) 賀淹才

(安徽科技學院動物科學學院1,鳳陽 233100)

(華僑大學材料科學與工程學院2,泉州 362011)

葡萄糖和蛋白胨對綠色木霉纖維素酶系分泌特性的影響

戴四發(fā)1賀淹才2

(安徽科技學院動物科學學院1,鳳陽 233100)

(華僑大學材料科學與工程學院2,泉州 362011)

采用正交試驗法分析出綠色木霉 3.3711液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶系各組分的最適酶解條件,其組合分別為 C1(pH 5.0、45℃),Cx(pH 3.5、55℃)和βG(pH 4.5、65℃)。在液體基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基發(fā)酵條件下,三種組分酶的最高酶活分別為 53.6、185.2、79.3 u/mL,比酶活分別為 46.6、167.7、71.8 u/mg,最高的酶活形成時間分別為 9、10、10 d。添加質(zhì)量分數(shù) 0.0005～0.003的葡萄糖,三種組分酶最高酶活分別降低了 27.4%～38.4%、25.5%～35.5%、14.0%～52.3%,C1和 Cx的最高酶活形成時間分別縮短為 4～7、5 d,C1和βG比酶活分別降低了 20.8%～35.4%、25.8%～64.5%;添加質(zhì)量分數(shù) 0.0005～0.01的蛋白胨,提高了 C1和 Cx最高酶活 (分別為 0.9%～199.6%、2.1%～45.1%),縮短了 C1和 Cx的最高酶活形成時間 (分別為 4～7、4 d),降低了βG的最高酶活 (5.9%～34.2%)和比酶活 (35.2%～87.3%),對 C1和 Cx比酶活的增減效應存在濃度依賴性,質(zhì)量分數(shù) 0.0005時分別提高 50.0%、65.4%。兩種添加物均能明顯改變 C1和 Cx的分泌變化規(guī)律,對βG酶影響極小。

綠色木霉 纖維素酶系 分泌特性 葡萄糖 蛋白胨

隨著近些年廣泛而深入的研究,纖維素酶在食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、紡織、化工等領域得到越來越廣泛的應用。真菌纖維素酶是一類復雜的復合酶系 (Cellu2 lase system),一般被認為包括三種水解酶,即內(nèi)切葡聚糖酶[endoglucanase;1,4(1,3,1,4)-β-D-glu2 can 4 glucanohydrolase;EC 3.2.1.4,簡稱 C1酶或EG]、外切葡聚糖酶 [exoglucanase;1,4-β-D-glu2 can cellobiohydrolase;EC3.2.1.91,簡稱 Cx酶 ,亦稱外切纖維二糖水解酶 (CBH)]和β-葡萄糖苷酶 (β-glucosidase;β-D-glucoside glucohydrolase;EC3.2.1.21,簡稱βG酶,亦稱纖維二糖酶)。C1酶與 Cx酶又存有多種異構酶。只有各組分酶協(xié)同作用才能將纖維素徹底水解為葡萄糖[1-2]。

綠色木霉是目前國內(nèi)外常用的一種生產(chǎn)纖維素酶的工業(yè)用菌,關于其產(chǎn)酶研究已有許多報道,普遍認為,該纖維素酶具有較高的 Cx和 C1酶活,但βG酶活較低 (與曲霉屬如黑曲霉纖維素酶相比),導致其徹底分解纖維素的能力受到限制[1,3-4]。前期的研究[1,5-8]中發(fā)現(xiàn),三種組分酶在發(fā)酵形成過程中存在明顯的時差性,Cx和 C1酶一般在 4～5 d即達到酶活的較高值或峰值,βG酶則在 8～9 d后才出現(xiàn)較高值。而目前關于綠色木霉纖維素酶活的分析報道一般都是在發(fā)酵的第 4～6 d時進行取樣的,且大多是依據(jù)單一組分酶 (一般是 Cx酶)的活性進行考慮的[4,9],進而導致對該酶系活性分析的片面性。因此,為了改善綠色木霉纖維素酶系各組分的均衡性以期有效提高其品質(zhì)和產(chǎn)量,有必要對該酶系各組分在發(fā)酵過程中的形成規(guī)律和一些營養(yǎng)素的影響效應進行深入研究。葡萄糖和蛋白胨能在微生物生長代謝過程中提供必需的碳源和氮源,是常用的培養(yǎng)基和發(fā)酵液成分,因此,本試驗針對綠色木霉纖維素酶系的分泌特性,就不同組分酶的最高酶活,、比酶活及最高酶活形成時間以及添加不同質(zhì)量分數(shù)的葡萄糖和蛋白胨對這些分泌特性的影響效應進行初步分析,為進一步深入探討該酶系分泌規(guī)律和提供工業(yè)生產(chǎn)參考建立一定的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種及來源

綠色木霉 (Trichoder m a viride)3.3711:中國科學院微生物研究所菌種組。

1.2 主要試劑與設備

纖維素粉、葡萄糖和蛋白胨:Sigma公司;754紫外可見分光光度計:上海精密科學儀器有限公司;SPX-150B生化培養(yǎng)箱:上海躍進醫(yī)療器械廠;KYC-111搖床:杭州雷琪實驗器材有限公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋:國華電器有限公司;BK5000生物顯微鏡:重慶奧特光學儀器有限責任公司。

1.3 培養(yǎng)基與菌種保藏

1.3.1 斜面培養(yǎng)基

土豆汁葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。將孢子接種于斜面培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng),待形成一層綠色孢子后 (約 7 d)于 4℃保藏備用。1.3.2 基礎培養(yǎng)基

加濃的Mandles鹽[5]添加質(zhì)量分數(shù)分別為 0.01和 0.02的纖維素粉和麥麩粉。1.3.3 產(chǎn)酶培養(yǎng)基

基礎培養(yǎng)基添加不同濃度的葡萄糖和蛋白胨。

1.4 孢子懸液與酶液制備

1.4.1 孢子懸液制備

從新長成的斜面洗下孢子,以磁力攪拌器攪拌約 20 min,打散孢子后顯微鏡記數(shù),并調(diào)節(jié)孢子濃度至 (1.00±0.05)×107個 /mL。

1.4.2 酶液制備

將孢子懸液以體積分數(shù) 0.1的接種量接入均裝有 50 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的 3只 250 mL搖瓶中,轉(zhuǎn)速190 r/min,28℃發(fā)酵培養(yǎng),每過 24 h取適量發(fā)酵液 3份,分別 4 000 r/min離心 15 min,以 0.1 mol/L磷酸氫二鈉 -0.1 mol/L檸檬酸緩沖液適當稀釋上清液即為酶液。

1.5 定糖分析

改進的 DNS法[6],以葡萄糖為標準,以相同稀釋倍數(shù)的酶液作為空白對照。

1.6 蛋白質(zhì)測定

Bradford法[5],以牛血清白蛋白為標準。

1.7 酶活測定和比酶活 (U0)計算

1.7.1 C1酶活測定

取 pH 5.0酶液 1.0 mL,加入裝有 (25.0±0.5)mg固體脫脂棉的試管中密封,于 45℃酶解 20 h后定糖。酶活力單位U(u/mL)為每小時由底物產(chǎn)生還原糖 (以葡萄糖計)的微摩爾數(shù)。

1.7.2 Cx酶活測定

取酶液 0.25 mL,加入 0.25 mL pH 3.5的質(zhì)量分數(shù)為 0.005的羧甲基纖維素鈉溶液中,于 55℃酶解 30 min后定糖。酶活力單位 (U)同 C1。

1.7.3 βG酶活測定

酶解底物為質(zhì)量分數(shù)為 0.005的水楊素溶液,酶解 pH為 4.5,溫度為 65℃。酶解方法同 Cx酶活測定,酶活力單位同 C1。

1.7.4 比酶活 U0(u/mg)的計算

U0=U/w,式中:w為蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù) /mg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠色木霉纖維素酶系各組分最適酶解條件分析

取以基礎培養(yǎng)基為產(chǎn)酶培養(yǎng)基制得的酶液作為試驗材料,通過兩因素 (pH和溫度 T)多水平正交試驗法分析 C1、Cx和βG的最適酶解條件。酶活結(jié)果分別見表 1～3。結(jié)果表明,C1酶最適作用條件組合為 pH 5.0和 45℃(酶活為 27.6 u/mL),Cx酶最適作用條件組合為 pH 3.5和 55℃(酶活為168.0 u/mL),βG酶最適作用條件組合為 pH 4.5和65℃(酶活為 9.7 u/mL)。

表 1 綠色木霉 3.3711纖維素酶系 C1酶最適酶解條件分析單位:u/mL

表 2 綠色木霉 3.3711纖維素酶系 Cx酶最適酶解條件分析單位:u/mL

表 3 綠色木霉 3.3711纖維素酶系βG酶最適酶解條件分析單位:u/mL

2.2 葡萄糖對綠色木霉產(chǎn)纖維素酶特性及酶系分泌特性的影響

2.2.1 葡萄糖對酶系各組分最高酶活、比酶活及其形成時間的影響

表 4表明,發(fā)酵液中添加葡萄糖,各組分最高酶活都明顯降低,分別降低了 27.4%～38.4%(C1)、25.5% ～35.3%(Cx)和 14.0% ～52.3%(βG),且降低程度均隨其質(zhì)量分數(shù)增高而增加;最高酶活形成時間除βG酶 (10 d)保持不變外,C1酶不同程度的由9 d縮短為 4～7 d,Cx酶均由 10 d縮短為 5 d;比酶活以 C1和 βG酶有明顯降低,分別為降低了20.8%～35.4%和 25.8%～64.5%,Cx酶則在質(zhì)量分數(shù)低于 0.000 75時有升高,高于 0.001時則降低。

表 4 葡萄糖對綠色木霉 3.3711產(chǎn)纖維素酶系各組分最高酶活、比酶活及其形成時間的影響

2.2.2 葡萄糖對酶系形成過程中各組分分泌規(guī)律的影響

由圖 2(以添加質(zhì)量分數(shù)為 0.000 5的葡萄糖為例)與圖1(基礎對照)間比較分析表明,添加葡萄糖,對βG酶的分泌規(guī)律影響較小,均是先緩慢上升后達到一定的峰值后便趨于穩(wěn)定;Cx酶活經(jīng)過高峰期后有較明顯的下降趨勢,穩(wěn)定性不如基礎對照組;C1酶的峰值期明顯提前,且經(jīng)一定的峰值穩(wěn)定期后略微下降,而基礎對照則無下降現(xiàn)象。

2.3 蛋白胨對綠色木霉產(chǎn)纖維素酶特性及酶系分泌特性的影響

2.3.1 蛋白胨對酶系各組分最高酶活、比酶活及其形成時間的影響

表 5表明,發(fā)酵液中添加蛋白胨,最高酶活以 C1和 Cx酶有不同程度的增加,分別為 0.9%～199.6%和 2.1%～45.1%,增加效應有明顯的質(zhì)量分數(shù)依賴性,最佳質(zhì)量分數(shù)分別為 0.004和 0.000 5;βG酶降低 5.9%～34.2%,隨質(zhì)量分數(shù)增加降低程度增加,質(zhì)量分數(shù)為 0.01時最顯著。Cx酶最高酶活形成時間均由 10 d縮短至 4 d;C1酶縮短為 4～7 d,隨添加質(zhì)量分數(shù)增加縮短程度增加;βG酶在質(zhì)量分數(shù)大于0.008時才略微縮短。比酶活以βG酶降低最顯著(降低 35.2%～87.3%);C1和 Cx酶因質(zhì)量分數(shù)不同而增減不一,均以質(zhì)量分數(shù)為 0.000 5時最高 (分別提高 50.0%和 65.4%),總體上各組分有隨質(zhì)量分數(shù)增加而降低的趨勢。

表 5 蛋白胨對綠色木霉 3.3711產(chǎn)纖維素酶系各組分最高酶活、比酶活及其形成時間的影響

2.3.2 蛋白胨對酶系形成過程中各組分分泌規(guī)律的影響

由圖 3(以添加質(zhì)量分數(shù)為 0.002的蛋白胨為例)與圖 1(基礎對照)間比較分析表明,蛋白胨對βG酶分泌規(guī)律幾乎無影響,但對 C1和 Cx酶的分泌規(guī)律影響極大,兩者均出現(xiàn)了一個極為明顯的峰值,且峰值期極短,峰值后均出現(xiàn)了兩次明顯的下降。

圖 3 質(zhì)量分數(shù) 0.002蛋白胨對綠色木霉 3.3711纖維素酶系分泌特性的影響

3 討論

自然界中的纖維素是目前地球是最為豐富和最具有潛力的可利用資源之一,利用纖維素酶的降解作用是合理利用纖維素資源的環(huán)保途徑,但纖維素酶的產(chǎn)量和酶解效率成為了這一途徑的“瓶頸”[1]。真菌類微生物是國內(nèi)外用于研究和生產(chǎn)纖維素酶的最主要的途徑,木霉屬中的綠色木霉就是其中的主要代表。綠色木霉纖維素酶屬于胞外酶,是一種含有 C1、Cx和βG酶三種組分酶的復合酶體系,纖維素最終降解為葡萄糖需要三種酶的協(xié)同作用。為有效提高綠色木霉纖維素酶的產(chǎn)量和該酶系的協(xié)同作用效果,需要對三種組分酶的分泌規(guī)律進行深入了解,本試驗通過液體發(fā)酵的方法,動態(tài)地分析了三種組分酶在發(fā)酵過程中的形成規(guī)律以及葡萄糖和蛋白胨的影響效應。

從一些研究報道分析[4-5,7-10],綠色木霉纖維酶系的三種組分酶在發(fā)酵過程中的形成規(guī)律是不同的,存在著明顯的時差性 (這可能是因為纖維素在不同分解時期所形成的不同產(chǎn)物對不同酶組分所起的反饋作用——誘導或阻遏[6]有不同),其中的 Cx和C1酶一般在 4～5 d即達到了較高的分泌量,而βG酶則在 8～9 d后才出現(xiàn)較高酶活,這在本研究中 (圖1～圖 3)也得到了充分的證實。由此可以進一步闡明,從不同發(fā)酵時間的發(fā)酵液中獲取的纖維素酶系間會存在 C1、Cx和βG三種組分酶的比例差異較大的現(xiàn)象,出現(xiàn)明顯的不均一性,進而導致同一發(fā)酵底物生產(chǎn)的酶系的酶解效率的差異性。以基礎培養(yǎng)基產(chǎn)生的酶系為例 (圖 4),發(fā)酵 4 d時三種組分酶活分別為 15.5、158.6和 7.7 u/mL,而 10 d時分別為52.6、185.2和 79.3 u/mL,其中 βG酶活占 Cx酶活的比例分別為 4.9%和 42.8%,差異極為顯著。由此,以前一些報道中關于綠色木霉纖維素酶系中βG酶活偏低的結(jié)論是存在一定的片面性的[11-12],也不能以單一組分酶代表整個酶系。故應按一種動態(tài)分析法對酶系各組分進行考慮,才能較為真實地反映出纖維素酶系的形成特性和酶解能力。

圖 4 基礎培養(yǎng)基不同發(fā)酵時間纖維素酶系各組分酶活

根據(jù)以上分析,為更加全面的了解綠色木霉纖維素酶系的分泌特性,有必要進一步探討一些因素如培養(yǎng)基組分、營養(yǎng)添加物、培養(yǎng)條件等對其分泌特性的影響。一些研究者[7-8,13-14]報道了發(fā)酵液 pH、碳源 (葡萄糖、纖維素、稻殼、麥麩等)、氮源 (尿素、酵母膏、蛋白胨等)、表面活性劑 (鼠李糖脂、吐溫 80等)、接種量等對不同組分酶活、形成變化規(guī)律和比酶活等部分特性的影響,本研究更加全面地分析了具有代表性的碳源 (葡萄糖)和氮源 (蛋白胨)對最高酶活、比酶活及最高酶活形成時間的影響,結(jié)果顯示,質(zhì)量分數(shù)為 0.000 5～0.003的葡萄糖顯著降低了三種組分酶的最高酶活、C1和 Cx的最高酶活形成時間以及 C1和βG比酶活;質(zhì)量分數(shù)為 0.000 5～0.01的蛋白胨明顯提高了 C1和 Cx的最高酶活,降低了 C1和 Cx的最高酶活形成時間及βG的最高酶活和比酶活,對 C1和 Cx的比酶活的增減效應存在濃度依賴性;兩種物質(zhì)對βG最高酶活形成時間均未產(chǎn)生明顯影響。說明添加物的種類和濃度對纖維素酶系的不同組分和分泌特性指標的影響效應均在顯著的差異性。

從圖 1～圖 3中各組分酶的分泌變化曲線分析,在發(fā)酵液中添加葡萄糖和蛋白胨,C1和 Cx酶均有較大的可變性,而βG酶則相對穩(wěn)定具有一定穩(wěn)定性,這提示通過添加營養(yǎng)添加劑的措施可以較好地對 C1和 Cx酶進行調(diào)控。特別值得提出的是,從圖 2～圖 3還發(fā)現(xiàn),兩種添加物對 C1和 Cx酶活形成峰值的穩(wěn)定性也產(chǎn)生了明顯影響,特別是蛋白胨對 Cx酶活的影響極為顯著,第 4 d達到峰值時的酶活為213.0 u/mL,而第 3、5 d則僅為 55.3、141.6 u/mL。說明蛋白胨在明顯提高 Cx酶活峰值的同時,卻大大縮短了峰值穩(wěn)定期。這對于生產(chǎn)來說是極為不利的性質(zhì),要求準確控制發(fā)酵時間才能達到良好的提高酶活效果,需進一步研究既能提高酶活峰值又能延長峰期穩(wěn)定性的添加劑或發(fā)酵措施等。

綜合以上分析,在發(fā)酵液中添加一些營養(yǎng)物是完全能夠改變綠色木霉纖維素酶系各組分的分泌特性的?？梢愿鶕?jù)不同的實際生產(chǎn)需要,有針對性的利用一些營養(yǎng)性培養(yǎng)基或代謝調(diào)節(jié)添加劑、改變發(fā)酵條件或調(diào)整發(fā)酵工藝等調(diào)控途徑進行生產(chǎn),達到專一提高纖維素酶系中某單一組分酶 (如 Cx酶)的產(chǎn)量或改善酶系中不同組分間的均衡性等目的。

4 結(jié)論

通過兩因素多水平正交試驗分析出,綠色木霉3.371 1液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶系中 C1、Cx和βG酶的最適作用條件分別為 (pH 5.0,45℃),(pH 3.5,55℃)和(pH 4.5,65℃)。在液體發(fā)酵和基礎產(chǎn)酶培養(yǎng)基條件下,三種組分酶的最高酶活分別為53.6、185.2和 79.3 u/mL,比酶活分別為 46.6、167.7和71.8 u/mg,最高酶活形成時間分別為 9、10和10 d。發(fā)酵液中添加質(zhì)量分數(shù)為 0.000 5～0.003的葡萄糖顯著降低了三種組分酶的最高酶活、C1和 Cx的最高酶活形成時間以及 C1和βG比酶活;添加質(zhì)量分數(shù)為 0.000 5～0.01的蛋白胨明顯提高了 C1和 Cx的最高酶活,降低了 C1和 Cx的最高酶活形成時間及βG的最高酶活和比酶活,蛋白胨對 C1和 Cx比酶活的增減效應存在濃度依賴性。兩種添加物均能明顯改變 C1和 Cx酶的分泌變化規(guī)律,對βG酶影響極小。

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Effects of Glucose and Peptone on Characteristics of Cellulase System Induced by Trichoder ma Viride

Dai Sifa1He Yancai2
(College ofAnimal Science,Anhui Science and TechnologyUnivesity1,Fengyang 233100)
(College ofMaterial Science and Engineering,Huaqiao University2,Quanzhou 362011)

By adopting orthogonal test,the optimal enzymolysis condition for respective components of cellulase system from Trichoder ma viride 3.3711 induced liquid fermentation are found to be pH 5.0,45℃for enzyme C1,pH 3.5,65℃for enzyme Cx,and pH 4.5,65℃for enzymeβG.Under the condition of liquid state and basic cul2 tivation fermentation,the highest enzyme activity(HEA)of the three components are 53.6,185.2 and 79.3 u/mL,enzyme activity ratio(EAR)are 46.6,167.7 and 71.8 u/mg,formation time of highest enzyme activity(FTHEA)are 9,10 and 10 d,respectively.Addition of 0.05%～0.3%glucose leads to decreasing HEA of the three compo2 nents by 27.4%～38.4%,25.5%～35.5%and 14.0%～52.3%,shortening FTHEA of C1 and Cx to 4～7 and 5 d,and decreasing EAR of C1 andβG by 20.8%～35.4%and 25.8%～64.5%,respectively.Addition of 0.05%～1.0%peptone leads to increasing HEA of C1 and Cx by 0.9%～199.6%and 2.1%～45.1%,shorten2 ing FTHEA of C1 and Cx to 4～7 and 4 d,and decreasing HEA and EAR ofβG by 5.9%～34.2%and 35.2%～87.3%,respectively.The effects of peptone on EAR of C1 and Cx are concentration dependent and concentration 0.05%leads to increasing the effects by 50.0%and 65.4%,respectively.Regarding to the rule of enzyme secretion of respective components,glucose and peptone both show a certain effect on C1 and Cx and few effect onβG.

Trichoder ma viride,cellulase system,secretory characteristic,glucose,peptone

Q556.03

A

1003-0174(2010)02-0107-06

2009-02-26

戴四發(fā),男,1973年出生,副教授,動物營養(yǎng)與飼料