夏新成 張衛(wèi)輝 劉麗華 滕安國 陳 佳 高 峰 周光宏

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,南京 210095)

復(fù)合發(fā)酵棉籽粕營養(yǎng)價(jià)值及活性產(chǎn)物分析研究

夏新成 張衛(wèi)輝 劉麗華 滕安國 陳 佳 高 峰 周光宏

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,南京 210095)

旨在研究復(fù)合固態(tài)發(fā)酵 (兩株酵母和一株霉菌)對棉籽粕脫毒效果及營養(yǎng)價(jià)值的影響,同時(shí)分析測定發(fā)酵底物中的活性產(chǎn)物。結(jié)果表明:復(fù)合發(fā)酵可極顯著降低棉籽粕底物游離棉酚含量 (P<0.01),降解率達(dá) 71.90%;棉籽粕底物粗蛋白、總氨基酸和必需氨基酸含量分別提高 28.96%、8.83%、7.58%;發(fā)酵 54～60 h時(shí)底物中蛋白酶活力最高 (酸性蛋白酶活力為 931.58 U/g,中性蛋白酶活力為 1 097.79 U/g,堿性蛋白酶活力為 798.62 U/g),纖維素酶活力最高 (濾紙酶活力為 1 601.66 U/g,Cx酶活力為 3 590.02 U/g,C1酶活力為1 685.35 U/g),淀粉酶活力最高為 578.05 U/g;同時(shí)發(fā)酵過程產(chǎn)生了一定量的有機(jī)酸。

橄欖假絲酵母 稻根霉 lindneri 固態(tài)發(fā)酵 棉籽粕 營養(yǎng)價(jià)值 活性產(chǎn)物

我國飼料資源不足,特別是蛋白質(zhì)飼料資源嚴(yán)重匱乏已成為影響我國畜牧業(yè)持續(xù)發(fā)展的主要因素之一。世界各國科技工作者對研究和開發(fā)新型蛋白質(zhì)飼料資源來替代魚粉、豆粕給予了廣泛的關(guān)注。作為重要的植物蛋白質(zhì)飼料資源——棉籽餅粕,由于存在棉酚,氨基酸含量低且不平衡,粗纖維含量高等因素限制了其在養(yǎng)殖業(yè)中的大量使用[1-2]。吳小月等[3]選用了不同微生物菌種發(fā)酵棉籽餅粕,結(jié)果表明:不同微生物菌種脫毒效果有明顯差異,其中N25菌種脫毒效果最佳,達(dá) 96.9%;發(fā)酵脫毒棉仁餅粕肉仔雞飼養(yǎng)試驗(yàn)亦取得了較好的經(jīng)濟(jì)效益。施安輝等[4]報(bào)道高效降解棉酚菌株的脫毒率可達(dá)82.2%,棉籽粕經(jīng)微生物脫毒后各種氨基酸含量明顯提高。Zhang等[5]研究表明經(jīng)微生物發(fā)酵后,棉籽粕中游離棉酚 (free gossypol,FG)含量顯著降低 (P<0.05),粗蛋白 (crude protein,CP)含量、總氨基酸含量和必需氨基酸含量顯著提高 (P<0.05)。目前研究主要是高效脫毒菌株的篩選及其脫毒效果和 CP、氨基酸含量變化等,但對發(fā)酵棉籽粕營養(yǎng)價(jià)值變化和發(fā)酵活性產(chǎn)物產(chǎn)生情況等尚缺乏全面評價(jià)。較為深入研究經(jīng)微生物處理前后棉籽粕營養(yǎng)成分變化及蛋白酶、纖維素酶、有機(jī)酸等活性物質(zhì)產(chǎn)生情況,為棉籽粕資源的充分利用提供有力的理論支持和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與菌種

棉籽粕:韓友飼料有限公司,粉碎,過 60目篩,其 FG含量為 728.27 mg/kg,粗蛋白含量為39.05%。

兩株酵母菌和一株霉菌:自制篩選,分別為酵母菌目酵母菌科假絲酵母屬橄欖假絲酵母 (Candida oleophila)、毛霉菌目毛霉菌科根霉菌屬稻根霉菌(Rhizopus oryzae)、酵母菌目酵母菌科克勒克酵母屬lindneri(Kloeckera lindneri[5])。

1.1.2 培養(yǎng)基與發(fā)酵底物制備

斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基,取去皮馬鈴薯200 g,切成小塊,加水 1 000 mL煮沸 30 min。濾去馬鈴薯塊,將濾液補(bǔ)足至 1 000 mL,加葡萄糖 20 g,瓊脂15 g,加熱煮沸溶化后分裝至試管中,量為試管的 1/3,121℃滅菌 30 min。待壓力表指針至 0 h時(shí)取出,放到一定傾斜度的平面上,使培養(yǎng)基占試管的 2/3,室溫下待培養(yǎng)基凝固后,放入培養(yǎng)箱30℃下 2～3 d,檢驗(yàn)滅菌是否完全后,可在無菌室中接種培養(yǎng)。

查氏培養(yǎng)基:蔗糖 (30 g)、NaNO3(2 g)、KCl(0.50 g)、FeSO4(0.01 g)、MgS O4·7H2O(0.50 g),K2HPO4(1.00 g)、H2O(1 000 mL)、瓊脂 (17 g)。自然pH,121℃滅菌 30 min。

將粉碎過篩后的棉籽粕、玉米與糖蜜按 7∶2∶1比例混合均勻,添加 3%硫酸銨構(gòu)成基礎(chǔ)底物。發(fā)酵時(shí)按底物與水為 1∶0.6比例加入水,121℃滅菌 30 min。

1.1.3 菌種制備

酵母菌液體菌種的制備:從斜面保存菌種上挑取一環(huán)菌苔接入 5 mL馬鈴薯液體培養(yǎng)基,在試管中30℃,150 r/min搖動(dòng)培養(yǎng) 48 h(一級菌種),取1.0 mL一級菌種接入 20 mL馬鈴薯液體培養(yǎng)基在100 mL三角瓶中 30℃,150 r/min搖動(dòng)培養(yǎng) 48 h(二級菌種)。

黑曲霉孢子懸液制備:從斜面保存菌種上挑取一環(huán)菌苔接入 5 mL查氏液體培養(yǎng)基,在試管中30℃,150 r/min搖動(dòng)培養(yǎng) 48 h(一級菌種),取1.0 mL一級菌種接入 20 mL查氏液體培養(yǎng)基在100 mL三角瓶中 30℃,150 r/min搖動(dòng)培養(yǎng) 48 h(二級菌種)。

1.1.4 試劑及儀器

結(jié)晶酚、羧甲基纖維素鈉、3,5-二硝基水楊酸:化學(xué)純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;kjelatecT M 2300蛋白質(zhì)自動(dòng)分析儀:FOSS公司產(chǎn)品;GC-14B氣相色譜儀:日本島津公司;淀粉酶 (AMS)測定試劑盒、乳酸測定試劑盒:南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗(yàn)方法與指標(biāo)測定

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)

將三菌株分別制備為二級菌種,接入 100 g到棉籽粕發(fā)酵底物,接種量為 5%,接種比例為 3∶3∶2,30℃固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng) 90 h,設(shè)三個(gè)重復(fù)。

1.2.2 FG含量的測定

參照國標(biāo) GB13086-1991[6]進(jìn)行測定。

1.2.3 常規(guī)養(yǎng)分含量分析

CP、粗脂肪及粗纖維等養(yǎng)分的測定參照文獻(xiàn)[7]的相關(guān)方法進(jìn)行測定。

1.2.4 還原糖含量的測定

采用 DNS法[8]進(jìn)行測定。

1.2.5 氨基酸含量的測定

采用L-8900型日立氨基酸自動(dòng)分析儀測定[9]。

1.2.6 淀粉酶活力、蛋白酶活力、纖維素酶活力的測定

棉籽粕發(fā)酵底物接種后于 30℃下恒溫靜置培養(yǎng) ,發(fā)酵過程中分別于 12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90 h取樣 ,監(jiān)測發(fā)酵過程中酶活力的變化情況。淀粉酶活力測定采用淀粉酶 (AMS)測定試劑盒 (碘 -淀粉比色法);蛋白酶酶酶活力測定采用中華人民共和國專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶活力測定方法ZBX66030-1987。纖維素酶酶活力測定采用 3,5-二硝基水楊酸比色法[10]。

1.2.7 有機(jī)酸含量測定[11-12]

采用氣相色譜分析及乳酸測定試劑盒測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用 Office EXCEL整理處理及 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫及復(fù)合發(fā)酵對棉籽粕底物 FG含量及 CP等養(yǎng)分含量的影響

高溫及復(fù)合發(fā)酵對棉籽粕底物 FG含量及 CP等養(yǎng)分含量的影響見表 1。結(jié)果表明高溫處理顯著降低棉籽粕底物中 FG含量,FG降解率為 41.81%,粗纖維含量略微降低,CP含量及粗脂肪含量無顯著變化。微生物復(fù)合發(fā)酵后,棉籽粕底物棉酚含量降解率為 71.90%,優(yōu)于高溫處理;同時(shí) CP含量 (提高率為 28.50%)和粗脂肪含量 (提高率為 22.77%)亦顯著提高,粗纖維含量顯著降低 (降解率為 25.16%)。

表 1 復(fù)合發(fā)酵對棉籽粕底物 FG含量及 CP等養(yǎng)分含量的影響

2.2 復(fù)合發(fā)酵對棉籽粕底物還原糖生成量的影響

復(fù)合發(fā)酵對棉籽粕底物還原糖生成量的影響見圖 1。發(fā)酵底物中還原糖含量隨發(fā)酵時(shí)間延長亦產(chǎn)生明顯變化。發(fā)酵前期底物還原糖含量降低,后期呈現(xiàn)上升趨勢并逐漸趨于平緩。

圖 1 復(fù)合發(fā)酵對棉籽粕底物還原糖生成量的影響

2.3 復(fù)合發(fā)酵對棉籽粕底物氨基酸含量的影響

復(fù)合發(fā)酵對棉籽粕底物氨基酸含量的影響見表2。結(jié)果表明,微生物復(fù)合發(fā)酵后,棉籽粕底物中 AA含量呈增加趨勢,EAA含量和 TAA含量提高率分別為 7.58%和 8.83%,其中甘氨酸 (Gly)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸 (Val)含量顯著發(fā)酵前 (P<0.05),蛋氨酸 (Met)含量極顯著高于發(fā)酵前 (P<0.01)。

表 2 復(fù)合發(fā)酵對棉籽粕底物氨基酸含量的影響/%

2.4 復(fù)合發(fā)酵對棉籽粕底物淀粉酶活力的影響

復(fù)合發(fā)酵對棉籽粕底物淀粉酶活力的影響見圖2。棉籽粕底物經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶,其活力前期隨時(shí)間延長而逐漸升高,60 h時(shí)最高達(dá) 578.05 U/g,隨后逐漸降低。

圖 2 復(fù)合發(fā)酵對棉籽粕底物淀粉酶活力的影響

2.5 復(fù)合發(fā)酵對棉籽粕底物蛋白酶產(chǎn)生的影響

復(fù)合發(fā)酵對棉籽粕底物蛋白酶產(chǎn)生的影響見圖3。結(jié)果表明,棉籽粕底物發(fā)酵過程中產(chǎn)生了蛋白酶,隨著時(shí)間的延長,其活力亦產(chǎn)生顯著變化。發(fā)酵前期蛋白酶活力呈現(xiàn)升高趨勢,發(fā)酵時(shí)間達(dá) 54 h,蛋白酶活力達(dá)到最高 (酸性蛋白酶活力為931.58 U/g,中性蛋白酶活力為 1 097.79 U/g,堿性蛋白酶活力為798.62 U/g),而后逐漸降低。

圖 3 復(fù)合發(fā)酵對棉籽粕底物蛋白酶產(chǎn)生的影響

2.6 復(fù)合發(fā)酵對棉籽粕底物纖維素酶產(chǎn)生的影響

復(fù)合發(fā)酵對棉籽粕底物纖維素酶產(chǎn)生的影響見圖 4。結(jié)果表明棉籽粕底物發(fā)酵過程中產(chǎn)生了纖維素酶,其活力隨時(shí)間呈現(xiàn)顯著變化。發(fā)酵前期纖維素酶活力逐漸升高,至發(fā)酵 54～60 h達(dá)最高[濾紙酶活力為 1 601.66 U/g,Cx酶 (葡聚糖內(nèi)切酶)活力為3 590.02 U/g,C1酶 (葡聚糖外切酶)活力為1 685.35 U/g],隨后逐漸降低。

圖 4 復(fù)合發(fā)酵對棉籽粕底物纖維素酶產(chǎn)生的影響

2.7 復(fù)合發(fā)酵對棉籽粕底物有機(jī)酸產(chǎn)生量的影響

復(fù)合發(fā)酵對棉籽粕底物有機(jī)酸產(chǎn)生量的影響見表 3。結(jié)果表明,發(fā)酵后棉籽粕底物產(chǎn)生少量有機(jī)酸,其含量較發(fā)酵前又增加趨勢。

表 3 復(fù)合發(fā)酵對棉籽粕底物有機(jī)酸產(chǎn)生量的影響 mg/g

3 討論

3.1 復(fù)合發(fā)酵對棉籽粕棉酚含量及營養(yǎng)成分的影響

棉籽粕中含有棉酚、粗纖維含量高以及氨基酸含量低且不平衡等因素使其營養(yǎng)價(jià)值大打折扣。張文舉等[13]報(bào)道利用熱帶假絲酵母 ZD-3和黑曲霉ZD-8對棉籽餅底物進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵,可極顯著降低棉籽餅底物 FG含量,脫毒率為 91.64%;棉籽餅底物CP、總氨基酸、必需氨基酸含量分別提高 27.83%、18.15%、19.18%;提高 CP、總氨基酸及必需氨基酸體外消化率分別為 20.90%,26.16%、24.47%,賴氨酸和蛋氨酸分別增加 20.24%、66.29%。Kornegay等[15]、Wu等[5]和顧賽紅等[14]也有相關(guān)類似報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,發(fā)酵前后棉籽粕底物營養(yǎng)成分發(fā)生了顯著變化:FG降解率為 71.90%;CP、總氨基酸和必需氨基酸含量分別提高 28.96%、8.83%、7.58%,其中蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸含量增加顯著 (P<0.05);粗纖維含量降低 25.16%;粗脂肪含量提高 22.77%。Nagalakshmi等[23]研究報(bào)道部分棉籽粕中 FG與微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的氨基酸,或與活性蛋白中游離氨基結(jié)合為結(jié)合棉酚,從而失去活性;發(fā)酵處理后底物 CP含量的提高主要是由于微生物生長代謝作用引起。微生物生長代謝過程中,氧化消耗糖類物質(zhì),微生物大量生長繁殖,微生物菌體蛋白豐富,增加了 CP的含量[13,24]。

3.2 復(fù)合發(fā)酵對棉籽粕底物活性產(chǎn)物生成的影響

微生物發(fā)酵可產(chǎn)生多種酶類,同一菌種不同菌株分泌的酶的種類和數(shù)量是不同的。本研究篩選的菌株底物發(fā)酵過程中產(chǎn)生了淀粉酶,后者可將底物淀粉降解為單糖、雙糖等,微生物又可利用這些糖類進(jìn)一步生長繁殖,合成菌體蛋白。發(fā)酵過程中前期由于微生物的生長,底物還原糖含量消耗降低;48 h后其含量又呈現(xiàn)上升趨勢并逐漸趨于平緩,其原因可能為微生物代謝產(chǎn)生的纖維素酶積累而降解底物中纖維素使得還原糖含量有增加趨勢。試驗(yàn)中,底物發(fā)酵蛋白酶可將底物中蛋白質(zhì)降解為小分子蛋白和氨基酸等,有利于一定程度體外預(yù)分解飼料中的蛋白質(zhì),使氨基酸含量顯著提高,從而促進(jìn)動(dòng)物對蛋白質(zhì)的消化吸收利用[16-17]。發(fā)酵過程中酶活力變化顯著,54 h左右達(dá)到最高而后逐漸降低,其原因可能是因?yàn)?54 h后菌種產(chǎn)蛋白酶能力相應(yīng)降低,同時(shí)底物中亦可能產(chǎn)生抑制物,反饋抑制了酶的活性。

纖維素酶是一種多組分酶,包括 C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶三種主要組分。C1酶的作用是將天然纖維素水解成無定形纖維素,Cx酶的作用是將無定形纖維素繼續(xù)水解成纖維寡糖,β-葡萄糖苷酶的作用是將纖維寡糖水解成葡萄糖。濾紙是聚合度和結(jié)晶度都居“中等”的纖維性材料,以其為底物經(jīng)纖維素酶水解后生成還原糖的量來表征纖維素酶系總的糖化能力,它反映的是纖維素酶各組分的協(xié)同作用,統(tǒng)稱為濾紙酶活 (FPA酶)[18]。本研究表明,底物發(fā)酵過程中產(chǎn)生纖維素酶,其能夠?qū)Φ孜锎掷w維作用,從而降低粗纖維含量,提高棉籽粕營養(yǎng)品質(zhì)[19]。

酵母、霉菌等多種微生物均可發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸,微生物在碳水化合物代謝過程中,有氧降解被中斷而積累各種有機(jī)酸[20]。研究選用的三株菌發(fā)酵產(chǎn)生了少量有機(jī)酸。有研究報(bào)道飼料中添加有機(jī)酸,具有降低動(dòng)物胃腸道 pH,改善消化道微生物區(qū)系,促進(jìn)礦物質(zhì)、維生素吸收,提高消化酶活性,抗應(yīng)激等作用;從而對改善動(dòng)物生產(chǎn)性能、提高飼料利用率,增強(qiáng)動(dòng)物的免疫力免疫等方面具有重要作用[21-22]。

4 結(jié)論

經(jīng)微生物發(fā)酵后,由于 FG與培養(yǎng)基中氨基酸等物質(zhì)結(jié)合或微生物分泌的酶類分解 FG,使其含量顯著降低;同時(shí)微生物大量生長繁殖,產(chǎn)生大量菌體蛋白,底物粗蛋白含量顯著增加;同時(shí)微生物生長代謝產(chǎn)生氨基酸、蛋白酶、纖維素酶、有機(jī)酸等多種活性物質(zhì),它們在促進(jìn)消化,提高動(dòng)物生產(chǎn)性能,提高免疫力等方面發(fā)揮著重要作用。

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NutritionalValue and Active Products of Compound Fer mented CottonseedMeal

Xia Xincheng ZhangWeihui Liu Lihua Teng Anguo Chen Jia Gao Feng Zhou Guanghong
(College ofAnimal Science and Technology,NanjingAgricultural university,Nanjing 210095)

The effect of mixed culture solid fermentation on detoxification and nutritional value of cottonseed mealwas investigated.Cottonseed meal was fer mented with three strains(Rhizopus oryzae,Candida oleophila and Kloeckera lindneri),then the reducing sugar content,protease activity,cellulase activity,amylase activity and organic acid content of the fermented cottenseed meal were analyzed,and its free gossypol(FG)content,crude protein(CP)content and amino acid contents were also determined.Results:The mixed culture fer mentation significantly(P<0.01)decreases FG content in the fermented cottonseed meal,making a detoxification rate up to 71.90%.The CP content,total amino acids and essential amino acids are increased by 28.50%,8.83%,7.58%,respectively.The protease activities of the cottenseed meal after 54～60h fermentation are enhanced to peak values,namely,acid proteinase activity 931.58 U/g,neutralproteinase activity 1097.79 U/g,and alkaline protease activity 798.62 U/g;the cellulase activities are also enhanced to peak values,such as filter paper activity(FPA)1601.66 U/g,Cx en2 zyme activity 3590.02 U/g,and C1 enzyme activity 1685.35 U/g.The amylase activity of the fermented cottenseed meal is enhanced to a peak value of 578.05 U/g.Meanwhile,a certain amount of organic acids are produced in the fer mentation.

Candida oleophila,Rhizopus oryzae,lindneri,solid-state fermentation,cottonseed meal,nutri2 tional value,active products

S816.6

A

1003-0174(2010)02-0096-05

2009-02-19

夏新成,男,1984年出生,碩士,動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)

高峰,男,1970年出生,教授,動(dòng)物營養(yǎng)生理