牟旭鵬 韋安慧 申茉函 孔 寧 顏煒群 (吉林大學(xué)藥學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130021)

甲型流感病毒M2e與人血清白蛋白融合蛋白在畢赤酵母中的分泌表達(dá)

牟旭鵬 韋安慧 申茉函 孔 寧 顏煒群 (吉林大學(xué)藥學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130021)

目的 將甲型流感病毒M2蛋白胞外區(qū)(M2e)基因與人血清白蛋白 (HSA)基因融合,以構(gòu)建高效分泌表達(dá)的畢赤酵母菌株。方法

通過 RT-PCR擴(kuò)增 HSA基因,構(gòu)建 pPICZα-HSA質(zhì)粒,將人工合成的M2e序列與 pPICZα-HSA質(zhì)粒分別經(jīng)BstB I和 KpnI酶切消化后連接,構(gòu)建真核表達(dá)載體 pPICZα-HSA/M2e,線性化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母 X-33。用 PCR法篩選 Zeocin抗性陽性的克隆,SDS-PAGE和Western印跡法篩選高表達(dá) HSA/M2e菌株。結(jié)果 經(jīng) RT-PCR法克隆的 HSA基因序列與 GenBank登錄的 cDNA序列一致,構(gòu)建的 pPI CZα-HSA/M2e真核表達(dá)載體,經(jīng)電轉(zhuǎn)化獲得Zeocin抗性陽性的克隆。SDS-PAGE和Western印跡分析證實(shí)了甲醇誘導(dǎo)的培養(yǎng)基上清中含有 HSA/M2e,分子量約為 68 kD。結(jié)論 成功構(gòu)建了分泌表達(dá)重組 HSA/M2e融合蛋白的畢赤酵母菌株,為進(jìn)一步研究其生物學(xué)活性奠定了基礎(chǔ)。

甲型流感病毒;M2e;血清白蛋白;畢赤酵母

M2蛋白是流感病毒主要的膜蛋白之一,由流感病毒基因組第 7節(jié)段編碼,長(zhǎng) 97個(gè)氨基酸,N末端 24個(gè)氨基酸殘基暴露在胞膜外,C端的 54個(gè)氨基酸定位于胞漿中,中間 19個(gè)氨基酸殘基跨過脂質(zhì)雙分子層。研究發(fā)現(xiàn)M2蛋白的單克隆抗體具有在細(xì)胞培養(yǎng)中抑制病毒復(fù)制的功能〔1〕,進(jìn)一步證明M2蛋白胞外功能區(qū) (extracellular domain ofM2 protein,M2e)誘生的抗體同樣具有保護(hù)性〔2〕。由于目前在人群中流行的所有甲型流感病毒,其M2e都未發(fā)現(xiàn)存在明顯差異,認(rèn)為M2e在流感病毒株間是高度保守的〔3〕。因此,M2e蛋白被認(rèn)為是可刺激機(jī)體產(chǎn)生對(duì)不同流感變異株都具有交叉保護(hù)效果的保護(hù)性抗原。本研究旨在構(gòu)建 HSA/M2e的真核表達(dá)質(zhì)粒,將M2e與 HSA在畢赤酵母中進(jìn)行融合表達(dá),為進(jìn)一步研究M2e蛋白疫苗的免疫效果,開發(fā)和應(yīng)用具有交叉保護(hù)能力的長(zhǎng)效廣譜疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

表達(dá)載體 pPICZα及畢赤酵母菌株 X-33購(gòu)自 Invitrogen公司;Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶等購(gòu)自 TaKaRa公司;瓊脂糖 DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取和純化試劑盒以及大腸桿菌 XL1-Blue購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司;引物由上海生物工程公司合成;小鼠抗人血清白蛋白單克隆抗體購(gòu)自博奧森公司,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠抗體購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司。

主要儀器：PCR儀、孵箱、搖床為 Forma公司產(chǎn)品;電穿孔儀MicroPulser購(gòu)自 B IO-RAD公司;DNA測(cè)序儀為 Beckman公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 總 RNA的提取和 RT-PCR 用 Trizol法從新鮮分離的胚胎肝組織中提取總 RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和設(shè)計(jì)的引物(上游引物 ：5′-CAGGAATTCGGCACAATGAGTGGGT-3′,下游引物 ：5′-GCGCTCGAGGTAGATGTTATAAGCCT-3′),以 RT-PCR法擴(kuò)增 HSA cDNA片段。反應(yīng)產(chǎn)物做 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2 HSA cDNA的克隆及測(cè)序 擴(kuò)增的特異性片段進(jìn)行回收和純化后,連接于 pMD18-T載體上,將重組質(zhì)粒 pMD18-THSA轉(zhuǎn)化大腸桿菌 XL1-Blue,通過α-互補(bǔ)的藍(lán)白篩選挑選重組子。經(jīng)酶切電泳鑒定后,選出重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 pPICZα-HSA載體的構(gòu)建 將測(cè)序正確的 pMD18-THSA重組質(zhì)粒進(jìn)行 PCR(上游引物 5′-GCGTTCGAAATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCC-3′含 BstB I酶切位點(diǎn) ;下游引物 ：5′-GTCGGTACCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3′含 KpnI酶 切位點(diǎn)),PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒 pPICZα分別經(jīng) BstB I和 KpnI酶切消化,用 T4 DNA連接酶連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌XL1-Blue,以含 Zeocin(25μg/ml)的平板篩選轉(zhuǎn)化子,提取質(zhì)粒,限制酶切鑒定重組質(zhì)粒。

1.2.4 pPICZα-HSA/M2e表達(dá)載體的構(gòu)建 將人工合成的M2e序列與 pPI CZα-HSA質(zhì)粒分別經(jīng) Eco81I和 KpnI酶消化并經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳回收特異片段,用 T4 DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 XL1-Blue,挑取轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒,限制酶切鑒定重組質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 pPICZα-HSA/M2e轉(zhuǎn)化畢赤酵母 X-33 用 PmeI線性化 pPI CZα-HSA/M2e,通過電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入酵母 X-33菌株的感受態(tài)細(xì)胞。具體操作程序按 Pichia Expression Kit提供的方法。取 50～100μl轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含 Zeocin(100μg/ml)的 YPD培養(yǎng)板,于 30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng) 2～3 d,觀察轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)。

1.2.6 酵母工程菌的誘導(dǎo)表達(dá) 從轉(zhuǎn)化菌的 YPD板上挑取10個(gè)克隆分別接種于 10 ml BMGY培養(yǎng)基中,30℃震蕩培養(yǎng)(225 r/min)24 h,至 OD600達(dá) 2～6。室溫離心 (3 000 r/min)5 min,棄上清。用等體積 (10 ml)BMMY重懸細(xì)胞沉淀,30℃震蕩培養(yǎng),誘導(dǎo)表達(dá)。在誘導(dǎo)過程中,每 24 h補(bǔ)充 1次甲醇至終濃度 0.5%,同時(shí)補(bǔ)充滅菌超純水,使發(fā)酵液總體積保持不變。連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng) 7 d,每 24 h取 1 ml發(fā)酵液,離心,將菌體沉淀提取基因組 DNA做 PCR鑒定,上清進(jìn)行 SDS-PAGE及Western印跡分析。

1.2.7 表達(dá)產(chǎn)物的Western印跡分析 PCR鑒定陽性的單克隆菌株,誘導(dǎo) 72 h后取培養(yǎng)液上清作 SDS-PAGE電泳 (5%的濃縮膠,10%的分離膠),電泳結(jié)束取出凝膠,200 mA恒流 1.5 h,將蛋白印跡于硝酸纖維素濾膜。用兔抗人血清白蛋白單克隆抗體為一抗,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體為二抗,DAB為顯色底物進(jìn)行Western印跡分析。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR擴(kuò)增 cDNA

經(jīng) 1%的瓊脂糖凝膠電泳分析表明,以肝組織 RNA為模板,經(jīng) RT-PCR法克隆到約 1 860 bp的基因片段,DNA測(cè)序結(jié)果證實(shí)所得基因序列與 GenBank登錄的HSA cDNA序列完全一致。見圖 1。

2.2 重組載體 pMD18-T-HSA的酶切鑒定

取重組質(zhì)粒pMD18-T-HSA用 PstI進(jìn)行雙酶切,得到約 700 bp的片段。見圖2。

圖 1 HSA RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

圖 2 重組質(zhì)粒 pMD18-T-HSA酶切鑒定圖譜

2.3 pPI CZα-HSA及 pPI CZα-HSA/M2e載體的酶切鑒定

將pPICZα-HSA及 pPICZα-HSA/M2e重組質(zhì)粒用 XbaI進(jìn)行雙酶切消化,分別得到約 700 bp及 793 bp大小的片段。見圖 3。

圖 3 重組質(zhì)粒 pPICZα-HSA及pPI CZα-HSA/M2e酶切鑒定圖譜

2.4 HSA/M2e在畢赤酵母中的表達(dá)及鑒定

提取的酵母基因組 DNA經(jīng) PCR擴(kuò)增到約 2 000 bp的片段,而對(duì)照無此條帶,表明 HSA/M2e基因已整合入酵母基因組中。見圖 4。將 PCR鑒定陽性的酵母菌誘導(dǎo)表達(dá) 7 d后取上清進(jìn)行 SDS-PAGE分析,結(jié)果顯示,陽性酵母菌在 68 kD附近有目的條帶出現(xiàn)。見圖 5。Western印跡分析顯示在甲醇誘導(dǎo)表達(dá)的上清中產(chǎn)生特異性條帶,表明該蛋白為 HSA/M2e。見圖 6。

圖 4 酵母基因組DNA PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

圖 5 HSA/M2e的 SDS-PAGE分析

圖 6 HSA/M2e的W estern印跡分析

3 討 論

M2蛋白是一種非糖基化的蛋白,其生物活性形式為四分子M2蛋白亞基依靠二硫鍵構(gòu)成一個(gè)同源四聚體〔4〕。雖然 M2蛋白在病毒粒子內(nèi)表達(dá)很少,平均每個(gè)病毒粒子大約含有 14～60個(gè)M2蛋白分子,但在被流感病毒感染的細(xì)胞表面可高效表達(dá)M2蛋白〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)用合成的 M2e多肽經(jīng)滴鼻接種小鼠后,也能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生很明顯的流感病毒抵抗力〔6〕,更重要的是M2e蛋白誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫是廣譜的,因此M2e被認(rèn)為是具有交叉保護(hù)能力疫苗的最佳候選。

人血清白蛋白是由 585個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈非糖基化的球形蛋白質(zhì),其本身即為許多內(nèi)源因子和外源藥物的載體,藥物和 HSA結(jié)合后,可以減少其生物利用度,同時(shí)增加在體內(nèi)的半衰期,從而可以提高療效〔7〕。同時(shí) HSA在畢赤酵母中可以高效分泌表達(dá),且上清雜蛋白含量較少,純化方便,因此更容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)。

本文通過 RT-PCR法擴(kuò)增 HSA基因,構(gòu)建 pPICZα-HSA/M2e真核表達(dá)載體,并對(duì)轉(zhuǎn)化 pPI CZα-HSA/M2e重組質(zhì)粒的畢赤酵母分泌表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,HSA/M2e能夠在畢赤酵母菌中實(shí)現(xiàn)較高表達(dá),分子量約為 68 kD,為今后開展基因工程疫苗以及通用疫苗的進(jìn)一步研究打下了基礎(chǔ)。

1 Zebedee SL,Lamb RA.Influenza A virusM2 protein;monoclonal antibody restriction of virus growth and detection ofM2 in virions〔J〕.J Virol,1988;62(8)：2762-72.

2 Neirynck S,Deroo T,Saelens X,et al.A universal influenza A vaccine based on the extracellular domain of theM2 protein〔J〕.NatMed,1999;5(10)：1157-63.

3 LiuWL,Zou P,Ding J,et al.Sequence comparison between the extracellular domain ofM2 protein human and avian influenza A virus provides new information for bivalent influenza vaccine design〔J〕.Microbes Infect,2005;7(2)：1171-7.

4 Sakaguchi T,Tu Q,Pinto LH,et al.The active aligomeric state of the minimalistic influenza virusM2 ion channel is a tetramer〔J〕.Proc Natl Acad SciUSA,1997;94(5)：5000-4.

5 Lamb RA,Zebedee SL,Richardson CD.Influenza virusM2 protein is an integral membrane protein expressed on the infected-cell surface〔J〕.Cell,1985;40(3)：627-33.

6 Mozdzanowska K,Feng JQ,EidM,et al.Induction of influenza type A virus specific resistance by immunization of mice with a synthetic multiple antigenic peptide vaccine that contains ectodomains of matrix protein 2〔J〕.Vaccine,2003;21(20)：2616-26.

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Secretory expression of HSA/M2e fusion protein in pichia pastoris

M U Xu-Peng,W EIAn-Hui,SHENM o-Han,et al.
School of Pharmaceutical Sciences of Jilin Un iversity,Changchun 130021,Jilin,China

Objective To fuse the gene ofM2e with that of HSA in order to construct a P.pastoris yeast strain with high-efficient expression of HSA/M2e.M ethods The gene of HSA was amplified by RT-PCR and the plasmid of pPI CZα-HSA was constructed.M2e artificial synthesized was digested with Eco81I and KpnI,then ligated to the same sites of pPICZα-HSA and obtained the expression vector pPICZα-HSA/M2e.The recombinant vectorwas linearized and introduced into P.pastoris X-33 by electroporation.Pichia pastoris secreting HSA/M2e were obtained to extract genomic DNA of transfor med X-33 and perfor m PCR.SDS-PAGE and Western blot was used to screen high expressed that HSA/M2e engineering bacteria and to identify HSA/M2e in culture supernatant induced bymethanol.Results The sequence of HSA obtained by RT-PCR was identicalwith that published on GenBank.Recombinant expression vector was constructed.SDSPAGE andWestern blot analysis showed that HSA/M2e was successfully expressed in the culture medium with an apparentmolecularweight of 68 kD.Conclusions Pichia pastoris yeast strain with high-efficient expression of HSA/M2e is successfully constructed,providing a basis for further study of its bioactivity.

Influenza A virus;M2e;Human serum albumin;Pichia pastoris

R373;Q78

A

〕 1005-9202(2010)05-0617-03

國(guó)家高技術(shù)發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃)項(xiàng)目資助課題

(2004AA205020)

顏煒群 (1958-),男,教授,主要從事生物工程學(xué)和再生醫(yī)學(xué)研究。

牟旭鵬 (1980-),男,在讀博士,主要從事醫(yī)學(xué)生物工程研究。

〔2009-11-18收稿 2009-12-10修回〕

(編輯 張永貴 /胡國(guó)義)