王 飛朱慶三 苗旭漫胡寧寧李 霄金寧一(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春 30033)

衣原體蛋白酶樣活性因子(CPAF)的克隆、表達(dá)及純化

王 飛1朱慶三 苗旭漫1胡寧寧2李 霄2金寧一2(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春 130033)

目的 構(gòu)建含衣原體蛋白酶樣活性因子(CPAF)的原核表達(dá)載體,經(jīng)轉(zhuǎn)化 E.coli以表達(dá) CPAF融合蛋白,研究其生物學(xué)功能。方法

從病料中克隆得到CPAF的原始基因,將 PCR產(chǎn)物經(jīng)純化連接到pMD18-T,將重組質(zhì)粒pMD-CPAF經(jīng)N de I和Bam H I雙酶切,與用相同酶消化的原核表達(dá)載體 pET42b(+)連接,建立 pET42b(+)-CPAF表達(dá)載體,陽性克隆經(jīng)鑒定后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá),經(jīng)親和純化、離子交換純化、分子篩純化融合蛋白,進(jìn)行 SDS-PAGE分析,W estern印跡檢測(cè)。結(jié)果 經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序分析證實(shí)原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。SDS-PAGE和W estern印跡結(jié)果顯示在 70 kD處呈現(xiàn)單一蛋白條帶,pET42b(+)-CPAF重組載體在大腸桿菌BL21(DE3)中成功地表達(dá)了 CPAF天然蛋白,目的蛋白占全菌體蛋白的20%左右,采用鎳柱的親和純化后,可達(dá)70%左右。結(jié)論 經(jīng)DNA測(cè)序、SDS-PAGE、W estern印跡檢測(cè)表明成功構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達(dá)可溶性 CPAF的菌株,并獲得純化CPAF的方法,為今后CPAF的研究及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

衣原體蛋白酶樣活性因子(CPAF);表達(dá);純化;生物學(xué)功能

衣原體泌尿生殖道感染是艾滋病病毒 (H IV)感染的重要危險(xiǎn)因素,也是人乳頭狀瘤病毒 (HPV)致宮頸癌的協(xié)同因子。衣原體具有廣泛的宿主,盡管不同種屬衣原體的宿主不盡相同,然而他們卻擁有極其相似的基因組序列和高度保守的細(xì)胞內(nèi)生活周期。衣原體要確保完成其胞內(nèi)繁殖,就必須保證受浸染細(xì)胞不被機(jī)體免疫細(xì)胞識(shí)別,從而逃逸宿主的免疫防御。衣原體擁有多種策略來逃逸宿主的免疫防御,衣原體蛋白酶樣活性因子 (ch lam ydialp rotease activity factor,CPAF)就是重要的一種因子,其作用的機(jī)制是通過降解形成肌球蛋白重鏈 (MHC)所必須的轉(zhuǎn)錄因子,例如:調(diào)節(jié)因子-X5(RFX5)和上游刺激因子-1(USF-1),來達(dá)到抑制MHC合成的作用〔1〕。人類受到衣原體感染時(shí),CPAF特異性抗體效價(jià)明顯高于外膜蛋白(MOMP)和熱休克蛋白 60(HSP60),這說明 CPAF具有良好的免疫原性。同時(shí),人體內(nèi)針對(duì) CPAF的抗體具有良好的中和效應(yīng),并能夠有效保護(hù)機(jī)體免受感染,具有抑制衣原體感染的效果〔2〕。種種跡象表明 CPAF極有可能成為潛在的衣原體免疫原,運(yùn)用到將來的疫苗開發(fā)中。本研究選擇對(duì) CPAF進(jìn)行全序列基因克隆,并在不同的載體系統(tǒng)中表達(dá) CPAF,獲得可溶性蛋白,同時(shí)摸索出能夠大量制備高純度蛋白的純化方法,為下一步應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 表達(dá)載體 pET42b(+)載體及工程菌BL21(DE3)由本研究室保存;pMD 18-T vector購(gòu)自大連寶生物公司。

1.1.2 病料 沙眼衣原體分離于病人組織。

1.1.3 主要試劑 工具酶均購(gòu)自大連寶生物公司,常用試劑及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自 Sigm a公司;PCR純化及凝膠回收試劑盒購(gòu)自 Q iagen公司;胰蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自 Oxiod公司。其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 模板的制備 按照細(xì)菌基因組提取方法改進(jìn)提取,在第 5步之后將上清加入 Sigm a試劑盒中的柱子,其后步驟按照Sigm a質(zhì)粒提取試劑盒說明書操作。

1.2.2 PCR引物設(shè)計(jì) 應(yīng)用 Prim er5.0設(shè)計(jì)引物,由大連寶生物公司合成。CPAF上游引物5′-GCCCGGCATATGCTCCTGTACAAGGAG-3′(引入 N de I位點(diǎn)),下游引物 5′-CTTGGGATCCAAAACTACCATCTT-3′(引入Bam H I位點(diǎn))。

1.2.3 目的基因擴(kuò)增 按如下程序進(jìn)行 PCR循環(huán):95℃預(yù)變性 5m in,94℃30 s,55℃30 s,72℃2m in,共循環(huán) 30次,最后72℃延伸 10m in。PCR產(chǎn)物的純化按照Q iagen公司 PCR純化試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 基因克隆 將 PCR產(chǎn)物經(jīng)純化連接到 pMD 18-T后轉(zhuǎn)化工程菌 JM 109。用 PCR、雙酶切篩選陽性克隆,陽性重組子命名為pMD-CPAF,送公司測(cè)序。

1.2.5 構(gòu)建表達(dá)載體 將 pMD-CPAF用N de I和Bam H I兩種酶同時(shí)消化,得到目的基因 CPAF。目的基因純化按照 Q iagen凝膠回收純化試劑盒說明書進(jìn)行。將 CPAF與用相同酶消化的原核表達(dá)載體 pET42b(+)連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL 21(DE3)后涂布含有卡那霉素(50m g/L)的固體培養(yǎng)基,經(jīng) PCR、酶切進(jìn)行陽性克隆篩選,將陽性重組子命名為 pET42b(+)-CPAF。

1.2.6 誘導(dǎo)表達(dá) 挑取陽性單克隆,接種于 2m lLB/Kanr液體培養(yǎng)基中,37℃搖床,250 r/m in過夜培養(yǎng)。次日以 1∶100比例接種至 200m lLB/Kanr液體培養(yǎng)基中,37℃250 r/m in培養(yǎng)至OD600=0.6～1。加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為 1mmo l/L,37℃誘導(dǎo) 5 h后,4 000 r/m in離心 10m in收集菌體,用 40m l TE緩沖液將沉淀重懸,超聲波破碎裂解菌體,離心后收集上清,用于檢測(cè)可溶性表達(dá)。

1.2.7 SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè) 常規(guī)制備 13%分離膠和4.5%濃縮膠電泳,考馬斯亮藍(lán)染色后用凝膠掃描影像系統(tǒng)拍照,并用系統(tǒng)軟件分析蛋白含量同時(shí)確定目的蛋白分子量。

1.2.8 CPAF的親和純化 將破碎上清液用 0.45μm濾膜過濾后加至經(jīng) 0.02mol/L Tris緩沖液(pH8.0)平衡好的 N i2+柱,用含有 0.015mol/L咪唑的 0.02mo l/L Tris緩沖液(pH 8.0)洗去未結(jié)合的雜蛋白,然后用含有 0.25mo l/L咪唑的 0.02mo l/L Tris緩沖液 (pH8.0)將 CPAF蛋白解離下來。

1.2.9 CPAF的離子交換純化 采用蛋白液相層析純化(AKTA)系統(tǒng)進(jìn)行純化,陰離子純化柱采用 SourceQ,溶液A為不含NaC l的 0.02 mo l/L Tris緩沖液 (pH8.0),溶液 B含 1 mo l/L NaC l的 0.02mol/L Tris緩沖液(pH8.0)。程序如下,將上述經(jīng)親和純化解離的樣品用A液稀釋 5倍后,直接上用A液平衡好的Q-FF柱,上完樣品之后用 1個(gè)柱體積的A液預(yù)洗滌,之后按照程序?qū)、B液混合,逐漸提高B液的含量進(jìn)行梯度洗滌,用自動(dòng)收集器收集樣品,每管收集 0.5m l。

1.2.10 CPAF的分子篩純化 采用AKTA系統(tǒng)進(jìn)行純化,分子篩純化柱采用 Superdex200,溶液 C為含 0.15mo l/L NaC l的0.02mo l/L Tris緩沖液 (pH 8.0)。程序如下,將上述經(jīng)離子純化的樣品經(jīng) 30 kD孔徑的超濾膜進(jìn)行超濾濃縮,將濃縮的樣品直接上用 C液平衡好的 Superdex200柱,樣品上完之后用 1個(gè)柱體積的 C液預(yù)洗滌之后開始用自動(dòng)收集器收集樣品,每管收集0.5m l。

1.2.11 W estern印跡檢測(cè) 將初步純化的 CPAF蛋白經(jīng)過SDS-PAGE后,轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜,以鼠抗組氨酸標(biāo)簽抗體作為一抗,進(jìn)行常規(guī)W estern檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因 PCR結(jié)果及陽性重組載體 pET42b(+)-CPAF的構(gòu)建與鑒定 將pMD-CPAF克隆載體用N de I和Bam H I兩種酶同時(shí)消化,得到目的基因 CPAF。用 T4 DNA連接酶將目的基因與用相同酶消化的表達(dá)載體 pET42b(+)連接 (圖 1)。設(shè)計(jì)引物時(shí)在目的基因的末端不含終止密碼子,表達(dá)蛋白為帶有組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白。見圖 1,圖 2。

圖1 pET42b(+)-CPAF的構(gòu)建示意圖

圖2 CPAF的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 CPAF融合蛋白表達(dá)條件的確定 經(jīng)過摸索確定的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件如下:IPTG終濃度為 1mmo l/L,培養(yǎng)菌的溫度及誘導(dǎo)溫度均為 37℃,最佳誘導(dǎo)時(shí)間為 5 h(5 h時(shí)蛋白濃度達(dá)最大,延長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)量沒有明顯變化)。取誘導(dǎo)前、全菌體、破碎上清、破碎沉淀進(jìn)行 13%濃度 SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍(lán)染色,誘導(dǎo)后與誘導(dǎo)前相比在 13 kD處存在一條明顯的特異帶,說明 pET42b(+)-CPAF重組載體在大腸桿菌BL21(DE3)中得以成功表達(dá),目的蛋白絕大部分存在于破碎上清中,說明該蛋白為可溶性表達(dá),這為以后研究其佐劑功效奠定了良好的基礎(chǔ)。經(jīng) Im agem asterVDSPharmbta B iotech凝膠掃描影像系統(tǒng)分析,目的蛋白占全菌體蛋白的 20%左右。

2.3 CPAF的純化

2.3.1 CPAF的親和純化 融合 CPAF蛋白帶有 6個(gè)組氨酸標(biāo)簽,采用鎳柱的親和純化后,蛋白的純度可達(dá) 70%左右,這時(shí)候蛋白在含有高咪唑的環(huán)境中很不穩(wěn)定,需要立即稀釋并迅速進(jìn)行離子交換柱的純化。

2.3.2 CPAF的離子交換純化 采用AKTA系統(tǒng)進(jìn)行純化,陰離子純化柱采用 Source Q,CPAF蛋白在 pH8.0的 Fris緩沖液條件下能夠很好的結(jié)合在離子交換樹脂上,易于分離純化,同樣也易于解離下來,見圖 3。

圖3 CPAF經(jīng) Source Q陰離子交換柱純化圖

2.3.3 CPAF的分子篩純化 采用AKTA系統(tǒng)進(jìn)行純化,分子篩純化柱采用 Superdex200,該步驟的目的主要是進(jìn)一步純化CPAF蛋白,同時(shí)改變蛋白的環(huán)境,使其處在一個(gè)低鹽的環(huán)境中,見圖4。

2.4 W estern檢測(cè)結(jié)果 純化產(chǎn)物在目的位置出現(xiàn)單一特異性條帶,未誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物未見特異性條帶。見圖 5。

3 討 論

近年來,由衣原體引起的性傳播疾病(STD)在許多國(guó)家已超過了淋病和梅毒。根據(jù)WHO估計(jì),每年有 9 200萬新的泌尿生殖道衣原體感染病例發(fā)生,其中美國(guó)每年大約有 400萬新感染者。我國(guó)泌尿生殖道沙眼衣原體感染居 STD第三位,并且發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)。衣原體具有無癥狀感染特性,感染后可能產(chǎn)生不孕、異位妊娠、盆腔炎等嚴(yán)重的后遺癥,甚至還可以協(xié)同HPV感染和H IV經(jīng)性傳播。

圖 4 CPAF經(jīng) Superdex200分子篩純化圖

圖 5 重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物及純化產(chǎn)物的W estern分析

衣原體全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)編碼多形態(tài)膜蛋白基因家族的存在。已發(fā)現(xiàn)鸚鵡熱嗜衣原體至少有 6個(gè)基因編碼Pmp90和 Pmp98蛋白家族,Cpn有 21個(gè)基因編碼 Pmp1～ Pmp21，衣原體有9個(gè)基因編碼PmpA-PmpH,其中Ct的 PmpD (Cpn的 Pmp21)引起過人們的廣泛關(guān)注〔3〕。衣原體不同型別間的核苷酸差異多發(fā)生于 4個(gè)VD區(qū)域,因此檢測(cè)編碼VD s的外膜蛋白 omp l堿基序列和數(shù)目即可達(dá)到對(duì)衣原體分型的目的。根據(jù)其主要外膜蛋白抗原表位差異可將衣原體分為 19個(gè)血清型,其中A、B/Ba、C型引起地方性沙眼,L1、L2/L2a、L3型引起性病性淋巴肉芽腫,而 D～K型則主要感染泌尿生殖道,是引起尿道炎和宮頸炎的重要原因〔4〕。近年來人們又將目光聚集在 CPAF上,人體內(nèi)針對(duì) CPAF的抗體具有良好的中和效應(yīng),并能夠有效保護(hù)機(jī)體免受感染,具有抑制衣原體感染的效果〔5,6〕。這一點(diǎn)給了人們不少啟示,認(rèn)為 CPAF可能成為衣原體潛在的免疫原〔7,8〕。由于衣原體只能在活細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng),通過大規(guī)模培養(yǎng)衣原體,并分離、純化天然的 CPAF很困難,為研究CPAF的功能和其生物活性,故采用 DNA重組技術(shù)克隆和表達(dá)重組CPAF。但是CPAF具有跨膜區(qū)域,全長(zhǎng)的CPAF表達(dá)量非常低而且常常形成不可溶的包涵體。本文根據(jù) CPAF的二級(jí)結(jié)構(gòu)根據(jù)不同區(qū)域的疏水性篩選 CPAF片段,最終發(fā)現(xiàn)從第 53個(gè)氨基酸開始到 596個(gè)氨基酸結(jié)束,這個(gè)片段的表達(dá)產(chǎn)物為可溶性的。這樣僅僅減少的幾個(gè)疏水部分就能導(dǎo)致蛋白的可溶,并提高了產(chǎn)物的表達(dá)量。該蛋白的純化具有相當(dāng)?shù)碾y度,CPAF在純化過程中很容易沉淀,全程均需要在 4℃下進(jìn)行,該蛋白對(duì)鹽離子濃度非常敏感,故在經(jīng)過陰離子交換柱后,蛋白應(yīng)盡快過分子篩,主要目的是脫鹽,保持其處在一個(gè)低鹽的環(huán)境中,有利于保持其穩(wěn)定性。

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〔2009-07-29收稿 2010-02-04修回〕

(編輯 袁左鳴)

book=635,ebook=44

R392.11

A

1005-9202(2010)05-0635-04

1 中國(guó)人民解放軍第 208醫(yī)院

2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

朱慶三(1959-),男,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事脊柱外科基礎(chǔ)與臨床研究。

王 飛(1981-),男,在讀博士,主治醫(yī)師,主要從事創(chuàng)傷及脊髓損傷研究。