柳 林，張文娟，田召芳

（煙臺(tái)市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，山東煙臺(tái) 264003）

大腸桿菌是Escherich在1885年發(fā)現(xiàn)的，是各種動(dòng)物的腸道常駐菌，分布非常廣泛。后來(lái)，人們才發(fā)現(xiàn)一些特殊血清型的大腸桿菌對(duì)人和動(dòng)物的致病性。

禽大腸桿菌病（Avian colibacillosis）是由致病性大腸桿菌（Escherichia coli）引起的局部或全身性疾病，包括急性敗血癥、氣囊炎、肝周炎、心包炎、卵黃性腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎、眼炎、關(guān)節(jié)炎、臍炎、肉芽腫以及肺炎等，最常見(jiàn)的為氣囊炎、肝周炎、心包炎、卵黃性腹膜炎、輸卵管炎等[1]。在臨床上往往不單獨(dú)發(fā)病，一般繼發(fā)于一些病毒病如新城疫、馬立克氏病、傳染性只氣管炎等。這類疾病在雞群中發(fā)病率一般為11%~69%，死亡率為3.2%~72.9%，且感染后的畜禽對(duì)沙門氏菌、新城疫、法氏囊病等細(xì)菌病和病毒病的易感性增高。各種品種及不同日齡的畜禽均可感染發(fā)病，該病給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。

雖然通過(guò)改善養(yǎng)殖條件及使用針對(duì)性的疫苗可以減少大腸桿菌病的發(fā)生，但最主要的防治措施仍然是使用抗菌藥物。然而由于抗生素的大量使用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的廣泛產(chǎn)生。隨著大腸桿菌耐藥菌株的不斷增多，大腸桿菌感染及其食品污染有不斷上升的趨勢(shì)，使人類食物中毒和胃腸炎不斷暴發(fā)，己成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)[2]，因此，控制耐藥菌的傳播和防治大腸桿菌感染已成為一個(gè)世界性難題。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)致病性大腸桿菌氨基糖苷類的耐藥性研究不多，而對(duì)雞源大腸桿菌的aad類基因的檢測(cè)研究尚未見(jiàn)有報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)藥敏試驗(yàn)，調(diào)查規(guī)?；u場(chǎng)致病性大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類的耐藥情況，用PCR技術(shù)對(duì)規(guī)?；u胚中分離的雞致病性大腸桿菌的鏈霉素、卡那霉素耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)研究，調(diào)查和了解規(guī)?；u場(chǎng)鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素的耐藥基因的分布和流行情況，建立大腸桿菌對(duì)氨基糖甙類代表性藥物鏈霉素、卡那霉素耐藥基因的PCR檢測(cè)技術(shù)，為我國(guó)控制大腸桿菌感染，制定用藥規(guī)范，減少抗生素殘留、降低耐藥性的擴(kuò)散和傳播及氨基糖苷類抗生素耐藥性的分子流行病學(xué)調(diào)查等提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)保證我國(guó)畜禽業(yè)養(yǎng)殖的健康發(fā)展，保證食品安全和人類的健康有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

電子天平 FA1004A，上海精天電子儀器有限公司；手提式高壓蒸汽消毒鍋YXQG02，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；超凈工作臺(tái)SW-CJ-1F，蘇州集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱YY0027-90，龍口電器有限公司；高速離心機(jī) TGL-16G，上海安亭科學(xué)儀器廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋 HH-2，國(guó)華電器有限公司；低速離心機(jī) TDL-5-A，上海安亭科學(xué)儀器廠；超速離心機(jī)85P-72，日本日立公司；紫外分光光度計(jì) UV-2012C，尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.2 試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂、普通肉湯、麥康凱瓊脂、三糖鐵瓊脂、各種糖發(fā)酵及生化鑒定培養(yǎng)基，均按常規(guī)方法配制；生化試管，購(gòu)于杭州天和微生物試劑有限公司；藥敏紙片：鏈霉素，卡那霉素，四環(huán)素，氯霉素，復(fù)合磺胺，呋喃妥因，萬(wàn)古霉素，頭孢呋新，頭孢噻污，頭孢派酮等購(gòu)自上海伊華醫(yī)科有限公司；DNA回收試劑盒，購(gòu)自寶泰克生物工程公司；Taq DNA 聚合酶（5 U／μL）、dNTP、MgCl2、10×buffer，購(gòu)于大連寶生物工程公司。

1.3 菌株

由本實(shí)驗(yàn)室分離自山東省滕州市某種雞場(chǎng)死亡雞胚及出殼弱雛

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

無(wú)菌采取死胚的肝臟或肺臟，直接劃線接種于麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h，挑取單個(gè)菌落，同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。純化后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)菌生化特性鑒定

按常規(guī)方法對(duì)致病菌進(jìn)行11項(xiàng)生化反應(yīng)鑒定[3]。

2.3 藥敏實(shí)驗(yàn)

將分離到的細(xì)菌涂布接種于麥康凱瓊脂平板上，間隔一定距離貼上各種抗生素藥敏試紙，于37℃培養(yǎng)24 h后觀察各抗生素抑菌情況[4-5]。

2.4 引物設(shè)計(jì)

選用4對(duì)源于馬孟根、王洪寧等的論文（豬源致病性沙門氏菌耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果）的引物（氨基糖甙類的aph3'-2，addB和四環(huán)素類的tetA，tetC）（表1），由上海生物工程有限公司合成，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明引物設(shè)計(jì)可靠。

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2.5 大腸桿菌耐藥基因的PCR擴(kuò)增和檢測(cè)

PCR擴(kuò)增體系：ddH2O 24.5μL，5×PCRbuffer（Mg2+）5.0 μL，MgCl25.0μL，dNTP 5.0μL，上、下游引物各2.5μL（25 pmol/μL），模板3.0 μL，Taq聚合酶 0.5μL（5 U/μL），總體積50μL。

PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變溫10 min；94℃變性30 s，退火溫度aph3-Ⅱ、tetC是54℃30 s，tetA是55℃30 s，aadB 58 ℃30 s，72 ℃延伸 30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。然后電泳檢查結(jié)果[6]。

2.6 耐藥基因的檢測(cè)及測(cè)序

2.6.1 回收DNA

用MO BIO公司Ultra CleanTM15DNA Purification Kit回收PCR產(chǎn)物。

2.6.2 DNA片段與載體DNA的連接

（1）連接體系DNA片段0.3 mL，載體 DNA 0.03-0.1 mL，T4DNA ligase 1 mL，10 T4DNA ligase buffer 2.5 mL，再加dH2O到25μL。

（2）在16℃下過(guò)夜連接。

（3）次日加2.5 mL3M NaAC和62.5 mL冷水乙醇，置-20℃30~60 min，再以12 000 r/min離心10 min后回收沉淀。

（4）用70%冷水乙醇清洗沉淀，干燥后用25~50μL的TE溶液。取10~20μL轉(zhuǎn)至100μL感受態(tài)。

2.6.3 感受態(tài)細(xì)胞的制備

參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（第二版）所述方法用CaCl2制備新鮮的大腸桿菌TG1菌株的感受態(tài)細(xì)胞[7]。

2.6.4 重組DNA的轉(zhuǎn)化

將10μL連接產(chǎn)物加到200μL新鮮制備的TG1感受態(tài)細(xì)胞中，混勻內(nèi)容物，冰浴上放置30 min。然后將離心管放入42℃循環(huán)水浴中90 s，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使之冷卻2~3 min。每管加LB培養(yǎng)基800μL，用水浴將培養(yǎng)基加溫至37℃，然后轉(zhuǎn)移至37℃搖床上溫育45 min以上，使細(xì)菌復(fù)蘇。取80~150μL菌液涂布到含有100μLg/mL AMP的LB瓊脂平板上。倒置平皿于37℃溫箱中培養(yǎng)過(guò)夜，次日挑取單個(gè)菌落進(jìn)行質(zhì)粒DNA的制備及鑒定[8]。

2.6.5 質(zhì)粒DNA的酶切鑒定

將上述所提質(zhì)粒各取3μL于0.8%瓊脂糖凝膠中90 V電泳30 min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并記錄結(jié)果，挑選DNA條帶相對(duì)滯后的質(zhì)粒DNA進(jìn)行EcoR I和salI雙酶切。酶切體系如下：質(zhì)粒DNA 5.0μL，ddH2O 12.0 μL，10×H Buffer 2.0 μL，EcoR I 0.5 μL，sal I 0.5 μL，總體積20.0μL。

混勻后，稍微離心，37℃酶切1.5 h，然后于0.8%瓊脂糖凝膠中90 V電泳45 min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并記錄結(jié)果。

2.6.6 序列測(cè)定

由上海生物科技有限公司完成。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

在麥康凱等培養(yǎng)基上呈現(xiàn)光滑、濕潤(rùn)有光澤的紅色菌落。

3.2 細(xì)菌的生化特性

生化反應(yīng)結(jié)果：吲哚陽(yáng)性；MR陽(yáng)性；V-P陰性；枸椽酸鹽陰性；H2S陰性；尿素陰性；分解乳糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、蔗糖不產(chǎn)酸產(chǎn)氣。所得生化試驗(yàn)結(jié)果證明所分離到的細(xì)菌為大腸桿菌。

3.3 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明6株大腸桿菌對(duì)氨基糖甙類和四環(huán)素類藥物的耐藥性最高，對(duì)磺胺類藥物次之，硝基呋喃類和氯霉素類藥物的耐藥性最低（表2）。

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3.4 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

以質(zhì)粒 DNA為模板對(duì)6株致病性大腸桿菌的aph（3'）-Ⅱ、addB、te tA、tetC基因進(jìn)行擴(kuò)增，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

只有2-3和2-5兩種細(xì)菌電泳條帶的大小和要擴(kuò)增的aph（3'）-Ⅱ的基因片段大小一致，其余的均沒(méi)有結(jié)果。

3.5 酶切目的DNA片段的電泳結(jié)果，如圖2。

3.6 耐藥基因的序列測(cè)定

序列結(jié)果顯示，共有582個(gè)堿基。A、G、C、T 四種堿基的分布為：A －24.91%（145/582）、G －24.24%（141/582）、C－21.48%（125/582）、T－29.38%（171/582）。

4 討論

4.1 關(guān)于大腸桿菌病的防治

氣候、環(huán)境和飼養(yǎng)方式的變化，特別是雞群較擁擠，是大腸桿菌病重要的誘發(fā)因素。所以要給予優(yōu)良的飼養(yǎng)環(huán)境如注意衛(wèi)生、通風(fēng)，減少應(yīng)激是預(yù)防該病的重要因素[9]。對(duì)于預(yù)防和治療該病，根據(jù)上述藥敏試驗(yàn)的結(jié)果，可避免幾種藥的使用，但由于該病病原對(duì)抗菌藥物極易產(chǎn)生抗藥性，使用敏感抗菌藥雖有一定療效但很容易復(fù)發(fā)。因此，一個(gè)療程后，必須注意更換抗菌藥物，且用藥劑量要足，以防形成抗藥性[1]。

4.2 關(guān)于藥敏試驗(yàn)結(jié)果

氨基糖甙類作為一類抗生素，因其價(jià)格低廉、作用范圍廣泛等優(yōu)點(diǎn)，曾廣泛地應(yīng)用于人醫(yī)、獸醫(yī)細(xì)菌性感染的防治，導(dǎo)致規(guī)?；u場(chǎng)大腸桿菌對(duì)氨基糖甙類藥物產(chǎn)生了較為廣泛的耐藥性[10]。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明：規(guī)?；B(yǎng)雞場(chǎng)對(duì)氨基糖甙類普遍存在耐藥性，耐藥率達(dá)到100%，而且大腸桿菌對(duì)除氨基糖甙類以外的多種抗生素也都產(chǎn)生了很強(qiáng)的耐藥性，這些都為我們臨床用藥提供了理論依據(jù)，建議在規(guī)?；u場(chǎng)中在進(jìn)行細(xì)菌性疾病的防治時(shí)，減少不敏感藥物的使用，要根據(jù)藥敏試驗(yàn)的結(jié)果選用合適的藥物。

4.3 關(guān)于耐藥基因PCR檢測(cè)技求

PCR技術(shù)以微量、重復(fù)性好、快捷等特點(diǎn)已在人醫(yī)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用，在醫(yī)學(xué)疾病診斷方面由于其特異、敏感、準(zhǔn)確、快速亦倍受青睞；在獸醫(yī)臨床上，常用此法進(jìn)行病原特異基因的檢測(cè)及克隆。既然基因突變及基因轉(zhuǎn)移是耐藥性存在的重要內(nèi)因，這就決定了檢測(cè)與抗生素耐藥性相關(guān)的基因具有重要意義。國(guó)外用此技術(shù)對(duì)部分細(xì)菌的耐藥機(jī)制進(jìn)行了深入探討，使耐藥質(zhì)粒的演變規(guī)律逐漸明了[11-12]。本實(shí)驗(yàn)用 PCR擴(kuò)增獲得aph（3'）-Ⅱ的基因片段，成功建立了大腸桿菌aph（3'）-Ⅱ基因的PCR檢測(cè)技術(shù)，從分子水平上檢測(cè)雞源致病性大腸桿菌的耐藥基因aph（3'）-Ⅱ，克服了藥敏試驗(yàn)只能檢測(cè)耐藥表型的缺點(diǎn)，可用于大腸桿菌對(duì)氨基糖甙類耐藥性的分子水平檢測(cè)。

本研究用PCR技術(shù)分別對(duì)6株耐藥的大腸桿菌的耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，在6株耐藥的大腸桿菌的質(zhì)粒上擴(kuò)出的基因aph3'-2，與藥敏試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性符合，具有較高的檢出率；其余5株耐藥大腸桿菌質(zhì)粒上擴(kuò)出的基因與藥敏試驗(yàn)陽(yáng)性不符合，檢出率較低。

4.4 關(guān)于序列分析

核苷酸序列分析能從分子水平上分析大腸桿菌對(duì)氨基糖甙類的耐藥性，了解其遺傳和生化機(jī)制。一方面，通過(guò)同源性比較，可了解來(lái)源相同和不同菌株核苷酸的變異情況；另一方面還可以根據(jù)已知序列，推定其編碼氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)和高級(jí)結(jié)構(gòu)，了解其耐藥性的生化機(jī)制，為抗生素工業(yè)中開(kāi)發(fā)新的抗生素提供理論依據(jù)。

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